软肝散结汤治疗酒精性肝炎的动物实验研究

韩波 青献春 吉军霞

[摘要]目的 通過动物实验研究软肝散结汤治疗酒精性肝炎的效果。方法 选取48只雄性Wistar大鼠，按照统计学原理随机分为对照组、造模组、低剂量组、高剂量组，各12只。其中低剂量组的中药与大鼠体重之比为10 g︰1 kg，高剂量组的中药与大鼠体重之比为20 g︰1 kg。对照组等体积给予饲料及蒸馏水，不予中药灌胃，模型组与对照组均给予饲料喂养；其余两组除饲料正常喂养外，将中药汤剂以相应剂量代替蒸馏水进行灌胃。造模42 d后采集标本，分别测定大鼠体重、肝湿重、肝指数、大鼠相关肝功能血生化指标，包括肝重、肝指数、大鼠体重、天冬氨酸氨基转移酶（AST）/丙氨酸氨基转移酶（ALT）、ALT、AST、血清清蛋白（Alb）、总蛋白（TP）、乙醇脱氢酶（ADH）、总胆红素（TBil）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及病理组织。结果 模型组的肝重、肝指数均高于对照组，大鼠体重低于对照组，低剂量组的肝重高于对照组（P<0.01）；高剂量组的肝重、肝指数均低于模型组，大鼠体重高于模型组，低剂量组的肝指数低于模型组，大鼠体重高于模型组（P<0.01）；高剂量组的肝重低于低剂量组（P<0.01）。模型组、低剂量组的AST/ALT、ALT、AST均高于对照组（P<0.01）；高剂量组的AST/ALT、ALT、AST均低于模型组、低剂量组（P<0.01）。模型组、低剂量组的Alb、TP均低于对照组（P<0.01）；模型组的TBil高于对照组（P<0.01）；高剂量组的Alb、TP均低于模型组、低剂量组（P<0.01），低剂量组、高剂量组的TBil均高于模型组（P<0.01）。模型组、低剂量组的MDA水平均高于对照组，SOD水平均低于对照组（P<0.01）；高剂量组的MDA水平低于低剂量组、模型组，SOD水平高于低剂量组、模型组（P<0.01）。模型组、低剂量组、高剂量组的脂肪变性、炎性浸润数值均高于对照组（P<0.01）；高剂量组的脂肪变性、炎性浸润值均低于模型组、低剂量组（P<0.01）。结论 软肝散结汤对酒精性肝炎有一定的治疗作用。

[关键词]软肝散结汤；酒精性肝炎；动物实验

[中图分类号] R575.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）7（c）-0004-05

[Abstract] Objective To study the effect of Ruangan Sanjie Decoction on alcoholic hepatitis by animal experiment. Methods Forty-eight male Wistar rats were selected and randomly divided into control group， model group， low-dose group and high-dose group according to statistical principles， with 12 in each group. The ratio of weight of Chinese herbal medicines to rat body weight in the low-dose group was 10 g to 1 kg， while in the high-dose group， the ratio was 20 g to 1 kg. In the control group， equal volume of fodder and distilled water was supplied， but without traditional Chinese herbal medicines for gastric irrigation. Fodder was provided in both the model group and the control group. For the other two groups， besides normal feeding， traditional Chinese decoction instead of distilled water in the same volume was used for gastric irrigation. After 42 d modeling， specimens were collected and the body weight， liver wet weight， liver index， and liver biochemical indices related to liver function were measured， including liver weight， liver index， rat body weight， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， AST/ALT， albumin （Alb）， total protein （TP）， ethanol dehydrogenase （ADH）， total bilirubin （TBil）， methylene dioxyamphetamine （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， and pathological tissue. Results The liver weight and liver index of the model group were higher than those of the control group， the weight of the rats was lower than that of the control group， the liver weight of the low-dose group was heavier than that of the control group （P<0.01）. The liver weight and liver index of the high-dose group were lower and the body weight was heavier compared with those in the model group， the liver index of the low-dose group was lower than that of the model group， and the body weight of the rats was heavier compared with those in the model group （P<0.01）. The liver weight of the high-dose group was lower than that of the low-dose group （P<0.01）. The AST/ALT， ALT， and AST in the model group and the low-dose group were higher than those in the control group （P<0.01）. The AST/ALT， ALT， and AST in the high-dose group were lower than those in the model group and the low-dose group （P<0.01）. Alb and TP were lower in the model group and the low-dose group than in the control group （P<0.01）. The TBil was higher in the model group than in the control group （P<0.01）. The Alb and TP were lower in the high-dose group than in the model group and the low-dose group （P<0.01）. The TBil level in the low- and high-dose groups was higher than that in the model group （P<0.01）. The levels of MDA in the model group and the low-dose group were higher than those in the control group， and the SOD levels were lower than those in the control group （P<0.01）. The MDA level in the high-dose group was lower than that in the low-dose group， the SOD level in the high-dose group was higher than that in the low-dose group and model group （P<0.01）. The values of steatosis and inflammatory infiltration in the model group， the low-dose group， and the high-dose group were all higher compared with those in the control group （P<0.01）. The steatosis and inflammatory infiltration values in the high-dose group were lower than those in the model group and the low-dose group （P<0.01）. Conclusion Ruangan Sanjie Decoction has a certain therapeutic effect on alcoholic hepatitis.

[Key words] Ruangan Sanjie Decoction； Alcoholic hepatitis； Animal experiments

酒精性肝病是引起世界范围内慢性肝病的主要原因[1]，该病发展过程缓慢，开始仅表现为酒精性脂肪肝，进一步则发展为酒精性肝炎，若治疗不及时，病情迁延日久则引起肝纤维化和肝硬化。酒精性肝病主要是由于酒精摄入过量而引起的肝功能异常变化的一种疾病[2]，其中酒精性肝炎的发病占酒精性肝病的46.7%，酒精性肝炎的防治已成为医学上的一个重要课题，该病主要癥状包括食欲缺乏、恶心、呕吐、腹胀、腹泻、腹痛、疲乏无力、体重减轻等[3]。2012年欧洲肝病学会临床实践指南指出酒精性肝病的实验室检查特点，包括天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平升高至正常上限的2～6倍，AST/丙氨酸氨基转移酶（ALT）>2，高胆红素血症和中性粒细胞增多症。严重者血清清蛋白（Alb）降低，凝血酶原时间（PT）延长，国际标准化比值（INR）升高。严重者易于发生细菌感染和急性肾衰竭[4]。随着现代社会的飞速发展，酒已经与人们的生活、工作紧密联系起来，酒过量饮用已经成为一个世界性的问题。酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因[5]。软肝散结汤以活血化瘀、清热解毒、滋养肝肾、健脾利湿为主要功效，治疗酒精性肝炎临床效果满意。本研究对软肝散结汤治疗酒精性肝炎进行了动物实验研究，现报道如下。

1材料与方法

1.1实验动物

选取48只3月龄雄性Wistar大鼠，体重（200±10）g，清洁型，购自青岛大学实验动物中心，合格证号：SCXK晋20120001清洁级WST大鼠。

1.2药物与试剂

软肝散结汤所需中药均购于山西中医药大学第二中医院中草药饮片药房，在实验室煎成汤剂后浓缩制成。在上海酶联生物科技有限公司购买试剂盒，在天津市天大化工实验厂购买磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，在石家庄四药有限公司购买0.9%氯化钠注射液，在天津科密欧化学试剂有限公司购买水合氯醛，在天津中泰化学试剂有限公司购买甲醛溶液。

1.3选模与给药

选48只雄性Wistar大鼠，按照统计学原理随机分为对照组、模型组、低剂量组和高剂量组，每组12只；其中低剂量组的中药与大鼠体重之比为10 g︰1 kg，高剂量组的中药与大鼠体重之比为20 g︰1 kg。对照组等体积予饲料和蒸馏水，不予中药灌胃；模型组和对照组均予饲料喂养；其余两组除了饲料正常喂养外，将中药汤剂以相应剂量代替蒸馏水进行灌胃。喂养时间共42 d（6周），然后采集标本[6]。

1.4标本采集

停药后，雄性Wistar大鼠禁食12 h，第一步按照水合氯醛10%的溶液与雄性Wistar大鼠体重的比以0.3 ml/100 g的量在腹腔内注射；第二步，雄性Wistar大鼠被麻醉后接着在腹主动脉取血，注入真空采血管，用一次性使用的不抗凝管，然后静置后以3000 r/min高速离心20 min后，血清会分离，把血清放入-20℃冰箱保存即可。第三步是剖开腹腔，取走肝脏，在生理盐水中反复冲洗数遍，直至干净而无淤血时，用滤纸吸干肝脏水分后称重，接着用刀切成1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的1块肝组织，然后用10%甲醛溶液处理并固定装瓶备用。

1.5指标检测

1.5.1雄性Wistar大鼠肝指数、大鼠体重、肝湿重的测定 将雄性Wistar大鼠麻醉后称量体重，予以记录。腹主动脉采血后，取出肝脏，在生理盐水中反复冲洗数遍，直至干净而无淤血，用滤纸吸干肝脏水分并称重，详细记录肝指数（肝指数=肝湿重/体重×100%）。

1.5.2雄性Wistar大鼠血清生化指标的测定 雄性Wistar大鼠血清生化指标一般包括总蛋白（TP）、清蛋白（Alb）、大鼠血清ALT、AST、乙醇脱氢酶（ADH）活性、总胆红素（TBil）。均应用RA1000全自动生化分析仪检测其含量，全部为酶法。另外，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量检测用上海酶联生物科技有限公司购买的试剂盒，按试剂盒说明方法来配比溶液测定。

1.5.3雄性Wistar大鼠肝组织病理学变化 第一步将雄性Wistar大鼠各组肝组织用常规处理，先用石蜡包埋，然后切片，并用HE染色。第二步将肝组织病理学形态在显微镜下观察。第三步是参照酒精性肝病肝脂肪变性炎症分级标准，以便设定肝组织病理学变化表，比较雄性Wistar大鼠各组肝组织病理学发生的变化程度。

1.6统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对数据进行分析，采用单因素方差（One-way ANOVA）分析进行显著性检验，方差分析前进行方差齐性检验，计量资料以均值±标准差（x±s）表示，采用t检验，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1动物一般情况观察

实验过程中，对照组大鼠饮食、精神和活动状况良好，体重持续增长，无死亡情况；模型组大鼠精神萎靡，食欲缺乏，体重增加缓慢，该组死亡2只；治疗高剂量组经给药治疗1周后精神状况较前逐渐好转，体重增加速度明显高于模型组，该组死亡1只；低剂量组经给药治疗后精神状况较前稍有好转，体重增加速度略高于模型组，该组死亡1只。

2.2各组雄性Wistar大鼠肝指数、肝重、体重的比较

模型组的肝重、肝指数均高于对照组，大鼠体重低于对照组；低剂量组的肝重高于对照组（P<0.01）。高剂量组的肝重、肝指数均低于模型组，大鼠体重高于模型组；低剂量组的肝指数低于模型组，大鼠体重高于模型组（P<0.01）。高剂量组的肝重低于低剂量组（P<0.01）（表1）。

2.3各组雄性Wistar大鼠血清生化指标的比较

模型组、低剂量组的AST/ALT、ALT、AST均高于对照组（P<0.01）；高剂量组的AST/ALT、ALT、AST均低于模型组、低剂量组（P<0.01）。模型组、低剂量组的Alb、TP均低于对照组（P<0.01）；模型组的TBil高于对照组（P<0.01）；高剂量组的Alb、TP均低于模型组、低剂量组（P<0.01），低剂量组、高剂量组的TBil均高于模型组（P<0.01）（表2）。

2.4各组雄性Wistar大鼠SOD、MDA水平的比较

模型组、低剂量组的MDA水平均高于对照组，SOD水平均低于对照组（P<0.01）；高剂量组的MDA水平低于低剂量组、模型组，SOD水平高于低剂量组、模型组（P<0.01）（表3）。

2.5各组大鼠肝组织病理学变化

2.5.1各组大鼠肝组织病理学变化 对照组的肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列；肝窦结构清晰，肝细胞无变性坏死（图1-A）。模型组中，大片肝细胞胞质疏松化，肝小叶结构紊乱，分界不清，可见大小不等、数量不一的脂肪空泡，肝窦扩大明显，门管区有灶性炎症细胞浸润和点状、灶状坏死，并有轻度纤维增生（图1-B）。低剂量组中，肝小叶结构紊乱，肝细胞可见到脂肪变性，有炎细胞浸润和轻度纤维增生（图1-C）。高剂量组中，肝小叶结构排列整齐，有少量散在脂肪变性，未见炎细胞浸润和纤维增生（图1-D）。

2.5.2各组大鼠肝组织病理学变化值的比较 模型组、低剂量组、高剂量组的脂肪变性、炎性浸润数值均高于对照组（P<0.01）；高剂量组的脂肪变性、炎性浸润值均低于模型组、低剂量组（P<0.01）（表4）。

3讨论

近年来相关研究的重要课题之一是用大鼠复制出接近人体的酒精性肝病全程病理改变动物模型。前期也有人在饮食中加入吡唑等醇脱氢酶抑制剂研究酒精造模[7]，但吡唑对人体肝脏有很大的毒性副作用。也有人用Tsukamoto-French大鼠造模，但较其他方法又复杂得多[8]。给大鼠长期喂Lieber饮料并不佳，能引起脂肪肝，但是至今尚未发现可致肝细胞坏死形成，也未发现肝纤维化的组织学依据[9]。较以往的大鼠造模，此次实验造模型有了显著改进，首先是改变了酒精的浓度，用50%北京二锅头加蒸馏水配制成40%白酒进行实验，给予雄性Wistar大鼠灌胃。前期实验使用50%白酒造模时[7]，大鼠死亡率约30%，经改进酒精浓度后大鼠的死亡率可降低至10%以下，以40%好于50%北京二锅头白酒灌胃造模。其次，每次灌胃量也不容忽视，如用40%白酒灌胃，每日给予大鼠的量采用1 ml（40%白酒）/kg（雄性Wistar大鼠的体重）模型效果较好，死亡率仅20%左右。最后对每天灌胃次数（每日2次、3次）比较，每日2次，死亡率约20%；每日3次，死亡率约40%，结果显示灌胃频次对大鼠寿命影响显著。

雄性Wistar大鼠酒精性肝炎造模成功后要进行检验，检验的步骤是抽血化验雄性Wistar大鼠的相关指标，若TP、Alb、ALT、AST含量升高大于正常值2倍，且AST/ALT>2，即认为造模成功。

本课题讨论的肝脏疾病，其主要的发病原因为长期大量饮酒超过了肝脏的代谢能力。其病理学特征主要表现为肝细胞坏死、中性粒细胞浸润、小叶中央区出现酒精性透明小体[10]。酒精性肝炎的临床表现差异很大，与组织学损害密切相关。酒精性肝炎的诊断主要根据其病史以及相关肝功能指标变化、影像学检查来实现。酒精性肝炎为酒精性肝病的一个阶段，如能及时戒酒和治疗大多能恢复。

酒精性肝炎是现代医学病名，当属中医学“酒疸”“胁痛”等范畴[11]。《灵枢·营卫生会》：“营出于中焦，卫出于上焦”。一般“饮”入胃走中焦，即《灵枢·营卫生会》所说的“蒸津液，化其精微，上注于肺脉”，亦即《素问·经脉别论》中的“游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺”之义。但酒入胃后，其“悍气”不走中焦而循卫气之道走上焦，“（上焦）出于胃上口，并咽以上，贯膈，布胸中……”（《灵枢·营卫生会》），所以，酒入胃则酒气上行，“气上逆满于胸中”。上逆之气不是卫气，不是积于胸中的宗气，而是酒气。《灵枢·论勇》载道：“酒者，水谷之精也。其气彪悍而有大毒。入则胃胀气逆，上逆于胸，内熏于肝胆，故令肝浮胆横[12]。”青献春教授则认为酒精损害肝脏的病因病机多为肝郁，其中中医辨证多为痰浊内蕴，水湿瘀血蕴积日久，严重损害了肝脏的生理正常功能；并结合王希利教授[13]依据《医宗必读》之论将该病分为初期、中期、末期三个阶段，并予以不同的治法。

软肝散结汤由党参、黄芪、当归、炒白术、炙甘草、生地、黄精、炒白芍、丹参、女贞子、旱莲草、鳖甲、龟板、板蓝根、郁金、茵陈、山药、神曲、泽泻、防己、秦艽、山楂组成[14]。其中党参补中益气，炒白术健脾益气，黄芪补中益气，当归养血补血，龟板、鳖甲滋阴清热、潜阳熄风、软坚散结，板蓝根清热解毒，七味药共成君药，以治其本；黄精益气养阴，丹参活血祛瘀，郁金活血止痛、行气解郁，茵陈利湿热，生地清热凉血、养阴生津，炒白芍养血敛阴以柔肝，旱莲草、女贞子组成二至丸共同滋补肝腎，此八味药共同组成臣药；山药健脾养阴，神曲消导积滞，泽泻利水消肿、渗湿，防己利水消肿，秦艽清利湿热，五味药通过健脾利湿、渗湿利水来辅助加强君药和臣药的功效，共同组成佐药；山楂健脾、活血散瘀，炙甘草补中益气、解毒、调和诸药，二味药有刚有柔，补中有泻，从而调和阴阳，与君药、臣药、佐药共同治疗疾病，此两药共成使药。全方共奏益气滋阴、健脾养血、活血化瘀、清热解毒、利湿之功。

依据中医诊断疗效标准及临床表现将酒精性肝病进行中医分型，分为肝胆湿热证、肝肾阴虚证、肝胃气滞证、脾肾阳虚证、痰郁阻络证[15]，对证治疗可获得好的疗效。

本实验研究显示，软肝散结汤对酒精型肝炎模型大鼠的体重降低、肝湿重增加有很好的改善作用，对酒精灌胃引起酒精性肝炎大鼠的TP、Alb、SOD降低及MDA、AST、TBil升高有一定的治疗作用[16]。

综上所述，软肝散结汤对酒精性肝炎有明显的治疗作用，这可能与其有改善肝细胞的结构功能、抗肝纤维化、降脂质和抗氧化等综合作用有关[17]。鉴于酒精滥用和酒精性肝病的发病率在发展中国家不断增加，并有低龄化和女性化趋势，戒酒是防治酒精相关问题的根本措施。酒精性脂肪肝戒酒4～8周后其肝组织学改变可完全恢复正常，保肝药物主要用于防治酒精性肝炎和肝纤维化[18]。

致谢：感谢山西省科技厅和山西省卫生计生委给予经费的大力支持，感谢董爱国博士和霍俊凤博士对课题的指导。

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（收稿日期：2018-02-27 本文编辑：祁海文）