综合基因表达谱分析与人类肝胰岛素抵抗相关蛋白分子表达研究*

黄发光，李小成，龚建平，李泽民

胰岛素的主要作用是调节机体血糖平衡和循环游离脂肪酸浓度。胰岛素抵抗是指其作用的靶器官（主要是脂肪组织、肝脏和肌肉）对胰岛素的敏感性降低，主要表现为骨骼肌和脂肪组织不能摄取足够的葡萄糖，同时肝脏合成的葡萄糖增多，胰岛素抵抗可增加循环游离脂肪酸浓度和导致异位脂肪累积。近年来，越来越多的研究表明肥胖与胰岛素抵抗之间存在因果关系[1]。肥胖是一种迅速增长的全球健康问题，通过增加关键组织或器官内的脂质积累，而引起代谢功能障碍和胰岛素抵抗。富含饱和脂肪酸的饮食可加剧肥胖症和肝脂肪变性，从而增加胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2DM）的发生风险[2]。研究观察到肥胖和T2DM患者非酯化脂肪酸（NEFAs）增加与胰岛素抵抗有关[3]，故认为NEFAs的释放是诱导胰岛素抵抗和损害β细胞功能的一个重要因素。另外，在肥胖症和T2DM患者，视黄醇结合蛋白4（RBP4）也可诱导胰岛素抵抗的产生，主要是通过减少肌肉组织磷脂酰肌醇3羟激酶【PI（3）K】信号传导和通过视黄醇依赖性机制增强肝脏葡萄糖源性磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的表达来实现[4]。Bohan[5]首次发现了糖尿病和肝硬化之间的关系，除了过度饮食、肥胖和缺乏运动外，慢性肝病也是导致高胰岛素血症的重要原因[6]。研究发现慢性肝病所致的糖尿病患者血清胰岛素水平高于因生活方式不良引起的相关糖尿病患者[7]。在慢性肝病患者，各种致病因素均可能参与了胰岛素抵抗的发生发展[8]，但胰岛素抵抗的发生机制及肝脏在胰岛素抵抗发生过程中的作用至今尚未完全阐明。本研究通过生物信息学方法分析人类肝组织胰岛素抵抗相关基因的表达差异，基于基因表达谱数据构建蛋白相互作用网络，筛选出有潜在调控作用的关键蛋白分子，以探索肝脏对胰岛素抵抗可能的调控信号通路。

1 资料与方法

1.1 基因表达谱数据的获得 从公共可获得的基因表达集（GEO）NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检索符合本研究的基因芯片数据。下载来源于人类胰岛素抵抗肝脏组织的基因表达谱数据集GSE23343[9]，芯片分析平台为GPL570（HG-U133-Plus-2）Affymetrix表达谱芯片。GSE23343数据集来源于日本金泽大学医学院，用于分析的人群包括10例2型糖尿病和7例血糖正常人的肝脏组织，通过经皮肝穿刺活组织检查获取肝脏组织，随后立即在液氮中冷冻和-80℃保存，直至使用。

1.2 差异基因表达谱分析 将下载的CEL格式原始数据上传至Gene-Cloud Biotechnology Information（GCBI, http://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index） 网站，进行差异基因分析。基因表达值为计量资料，2型糖尿病肝组织与正常对照肝组织之间的基因表达水平差异比较采用t检验，P值＜0.05、Q值＜0.05和差异倍数（fold change）＞1.2被设置为截止值，以滤除差异表达基因（DEGs）。

1.3 功能信号通路富集分析 基因本体论（gene ontology，GO）富集分析已经成为基因组或转录组数据大规模功能研究的常用方法[10]，注释、可视化和整合发现的数据库（DAVID，http://david.niaid.nih.gov）由一个集成的生物知识库和功能注释图表或表组成。该数据库为研究者提供了一套全面的功能注释工具，以整合特定功能的显著基因[11]。KEGG数据库（http://www.kegg.jp/）由生物化学途径的图形图表组成，包括大多数已知的代谢途径和调节途径[12]。我们利用DAVID在线工具对上调或下调基因进行GO生物过程功能富集和KEGG通路富集分析。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 蛋白质-蛋白质相互作用网络提供了许多有价值的信息，以了解细胞功能和生物过程。许多研究已经显示，在相同的相互作用中的蛋白质，即它们在构建的蛋白质-蛋白质相互作用网络中是相邻的，并具有一些共同的特征[13，14]。在本研究中，蛋白质-蛋白质相互作用网络是基于从STRING检索的蛋白质相互作用的信息（用于检索互作基因/蛋白质的搜索工具，http://www.string-db.org/）[15]。

2 结果

2.1 胰岛素抵抗与正常肝组织差异表达基因 通过对下载的数据集GSE23343进行分析，总共获得928个上调差异基因。差异基因表达谱宏观表象见图1。

2.2 差异基因功能通路富集分析 为了研究肝胰岛素抵抗基因在分子生物功能水平的表达情况，将筛选出的928个差异基因映射到GO数据库，GO生物过程富集发现差异基因主要富集在cellular process（FDR＜0.05，P=1.94-5）生物过程中（如表1）。KEGG通路富集分析表明差异基因主要富集在7条信号通路中（表2），包括两大类，即肿瘤相关通路（肾细胞癌、胶质瘤和非小细胞肺癌）和信号转导通路。

图1 胰岛素抵抗差异基因表达谱火山图 纵轴代表对P值取-log10，横轴代表对Fold-Chang取log2，右上角红色部分为上调的差异基因，蓝色部分为无统计学差异基因

表1 差异表达基因GO富集分析结果

2.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建可确定各差异表达基因/蛋白之间的相互作用关系。将928个肝胰岛素抵抗差异基因上传到String在线工具，得到差异蛋白相互作用网络图（图2），包括411个圆点，代表差异基因/蛋白，643条线表示相互作用关系，且每条线代表的关系均有相应的实验证明。无相互作用的基因/蛋白则被剔除。最终选出5个核心蛋白，即MDM2、PCNA、CAV1、PIK3R1、NR3C1。这些基因 /蛋白在蛋白质-蛋白质相互作用网络中与周围蛋白关系最密切，连线最多。可能在糖尿病患者肝脏组织中与胰岛素抵抗的产生相关。然后，从String网站下载蛋白质-蛋白质相互作用网络中相互作用点的坐标信息和相互作用关系文档，利用Viacomplex软件构建胰岛素抵抗差异基因/蛋白质相互作用的景观图，从宏观上可看出这些差异基因均为上调基因（图3）。

表2 差异表达基因KEGG通路富集分析结果

图2 蛋白质-蛋白质相互作用网络

图3 胰岛素抵抗差异基因/蛋白质相互作用的拓扑表示（景观分析）

3 讨论

胰岛素抵抗与高胰岛素血症、异常脂蛋白血症、高血压和几种非传统危险因素的异常（如内皮功能障碍、异常纤维蛋白溶解和炎症）相关[16]。既往研究表明肝脏可通过产生分泌蛋白来调节外周组织对胰岛素的敏感性或耐受性[9]，从而调节糖代谢平衡。另外，也有研究确定硒蛋白P（SeP）是一种由SEPP1基因编码的肝源性分泌蛋白，SeP在调节葡萄糖代谢和胰岛素敏感性中的作用已得到证实，并认为SeP可作为2型糖尿病一种潜在的治疗靶点[17，18]。但尽管许多实验已经阐述了胰岛素抵抗的发生机制，但尚无统一的定论，特别是肝脏在胰岛素抵抗中的作用无明确的实验论证。

本研究运用生物信息学方法，分析2型糖尿病患者与正常肝脏组织基因表达谱数据，识别胰岛素抵抗肝组织中的差异表达基因，进一步构建蛋白-蛋白相互作用网络，获取了5个关键基因/蛋白质，这些蛋白可能在肝胰岛素抵抗中发挥重要作用。既往研究表明，MDM2可参与CRY1介导的FOXO1降解，CRY1与FOXO1和MDM2可形成蛋白复合物，刺激FOXO1泛素化和降解，且在缺少MDM2的情况下使CRY1介导的FOXO1降解减弱[19]，而FOXO1是一种刺激糖原生成基因表达的关键转录激活因子[20]。FOXO1的降解可导致糖原生成减少，从而引起血糖升高。故我们可推测MDM2通过作用于FOXO1而与肝胰岛素抵抗的产生相关，具体调控机制有待进一步研究。

人类相关实验中未见PCNA与胰岛素抵抗及糖尿病相关的报道。在动物实验研究中显示，高脂饮食大鼠的血管周围脂肪组织中检测到PCNA表达，而这些大鼠表现有明显的胰岛素抵抗、高血糖症和高脂血症等[21]。在一项有机锡化合物诱导胰岛素抵抗和糖尿病的动物实验中发现，PCNA阳性细胞的百分比在胰岛素抵抗小鼠胰岛中显著减少，小鼠体内糖平衡被破坏[22]。PCNA与胰岛素抵抗可能相关，但相关关系尚不明确。

CAV1在胰岛素抵抗产生中的作用已被大量实验证明[23-25]，并有研究指出CAV1基因的变异与胰岛素抵抗和高血压相关，CAV1基因多态性可作为胰岛素抵抗和和高血压早期检测的生物标志物[25]。肥胖相关的胰岛素抵抗与脂肪肝、血脂异常和低血浆脂联素相关。最近研究报告在5例有PIK3R1基因C终端突变的患者中，4例存在重度胰岛素抵抗[26]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路是胰岛素和许多生长因子作用的中心。已经在患有SHORT综合征（以身材矮小，部分性脂肪营养不良和胰岛素抵抗为特征的疾病）患者中鉴定了编码PI3K的p85α调节亚基（PIK3R1）的基因存在杂合突变[27]。实验研究表明全身胰岛素抵抗与胰岛素和其他生长因子在肝、肌肉和脂肪中激活PI3K的能力降低相关[28]。NR3C1为糖皮质激素受体，与代谢综合征有关[29]，但未见与胰岛素抵抗相关的报道。

综上所述，本研究识别出的5个关键蛋白分子（MDM2、PCNA、CAV1、PIK3R1、NR3C1）可能在肝胰岛素抵抗中起到重要作用。基于基因芯片大数据分析进一步验证了先前实验研究发现的与胰岛素抵抗相关的部分蛋白分子。另外，也第一次提出了几个与人类肝脏组织胰岛素抵抗相关的新蛋白。今后可对这些候选基因实施进一步的基因表达验证和功能机制研究，以探索肝胰岛素抵抗产生的相关机制，为研制新的控制血糖药物提供潜在的作用靶点。