肿瘤干细胞标志物CD133和CD44在肾母细胞瘤中的表达及意义

陈天拓 何晶晶 苏义林 朱 凯

儿童期肾脏肿瘤多数来源于肾胚芽组织且多为恶性肿瘤，其中最常见的为肾母细胞瘤。Max Wilms于1899年对这类肿瘤的特点进行了描述，故称Wilms瘤。肾母细胞瘤约占小儿实体瘤的8%，并有一定的家族遗传性，目前认为其发病机制与WT基因突变和/或肾源性剩余有关[1]。根据肿瘤干细胞假说，肿瘤由一小部分维持正常干细胞共同特征的肿瘤干细胞维持。随着对肿瘤干细胞的深入研究，人们发现肿瘤干细胞是恶性肿瘤的根源，其含量与肿瘤的恶性程度、预后存在相关性[2]。CD133首先被发现是造血系统干细胞和祖细胞的标志物[3]，随后发现在很多类型肿瘤的干细胞中均表达CD133[4]。近期研究发现，CD133是小儿恶性肿瘤中最常见的干细胞标志物，包括肾母细胞瘤[5]、神经母细胞瘤[6]、肝母细胞瘤[7]和骨肉瘤[8]。CD133的表达与神经母细胞瘤的发生和进展相关，可作为其重要的预后分子标志物。CD44是细胞表面糖蛋白，主要表达于淋巴细胞、单核细胞和粒细胞，同时也发现是乳腺癌[9]、头颈肿瘤[10]、胰腺癌[11]和肠癌[12]干细胞标志物。本研究探讨肿瘤干细胞标志物CD133和CD44在肾母细胞瘤中的表达水平及其与患者临床分期的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年1月至2017年10月在安徽省立医院未进行放化疗而直接进行手术治疗的肾母细胞瘤患者，收集HE染色结果、病理报告以及临床病理参数(包括年龄、性别、肿瘤类型、肿瘤大小、肿瘤分期、分化程度等)。

1.2 试剂和设备 多聚甲醛、石蜡、乙醇和二甲苯购自国药集团；抗体稀释液、苏木素染液、封片剂、免疫组化检测(SP法)试剂盒(SP-9000)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CD133(ab19898)和CD44(ab6124)单克隆抗体购自英国Abcam公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司(CX31)；石蜡包埋机(EG1150)和切片机(RM2235)购自德国徕卡公司；离心管、枪头和EP管购自杭州爱思进生物技术有限公司。

1.3 组织切片制备和免疫组织化学染色 新鲜肿瘤组织用生理盐水漂洗1次后用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，制成2～5 μm厚组织切片。免疫组织化学染色步骤按照试剂盒说明书进行。苏木精复染后，自来水洗15 min，脱水、透明、封片、镜检。

1.4 免疫组织化学评分 为定量检测CD133和CD44在肾母细胞瘤组织中的表达情况，采用标准计分法将CD133和CD44的表达进行半定量分析，结果判定采用双盲法，由2位有经验的病理医师共同进行。评分标准如下：根据胞核或细胞质出现的颜色深浅判定阳性信号强度，无色为阴性记为0分，浅黄色为弱阳性记为1分，棕黄色为中等强度记为2分，棕褐色为强阳性记为3分。在高倍镜下(200倍)对每张切片随机选取5个视野，计算视野中阳性细胞百分比，最终的免疫组织化学评分按照阳性信号强度×阳性细胞百分比，评分范围为0～300分，以评分的中位数作为临界值来区分阴性和阳性标本[13]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计数资料用频数和率表示，率的比较采用χ2检验或校正的χ2检验，相关性分析用Spearman秩相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般特征 共收集肾母细胞瘤患儿64例，其中男性30例(47%)，女性34例(53%)。年龄中位数为36个月(8～120个月)，其中46例(74%)年龄≤36个月。肿瘤大小(最大直径)2～19 cm，中位数6.5 cm，其中32例(50%)≤6.5 cm。其中58例(91%)表现为预后好的病理特征；6例(9%)表现为预后差的病理特征，这6例中4例为局灶性增生，2例为弥漫性病变。根据NWTS分期[14]， 24例(37%)为1期，26例(41%)为2期，4例(6%)为3期，8例(12%)为4期，2例(3%)为5期。

2.2 CD133和CD44在肾母细胞瘤中的表达情况 CD133阳性信号强度分析显示，87%(56/64)的标本为阳性，其中44%(28/64)为弱阳性，37%(24/64)为阳性，6%(4/64)为强阳性；CD133阳性细胞计数显示，28%(18/64)的标本CD133阳性细胞数≥50%。CD44阳性信号强度分析显示，25%(16/64)的标本为阳性，其中13%(8/64)为弱阳性，6%(4/64)为阳性，6%(4/64)为强阳性；CD44阳性细胞计数显示，13%(8/64)的标本CD133阳性细胞数>50%(见图1)。分别计算CD133和CD44最终的免疫组织化学评分，计算结果显示评分的中位数为100分，因此，使用100分作为区分标本阴性和阳性的临界值，其中44%(28/64)的标本为CD133阳性，13%(8/64)的标本为CD44阳性。

2.3 CD133的表达情况与肾母细胞瘤临床病理参数的相关性 CD133的免疫组织化学评分与肾母细胞瘤NWTS分期存在正相关性(r=0.813，P=0.047)。在4期标本中CD133的阳性率为87.5%，而在1期标本中CD133的阳性率为25.0%(6/24)。此外，女性患者CD133评分高于男性患者(P<0.05)，但CD133评分与患者的年龄、肿瘤的大小及病理特征无相关性(P>0.05)。详见表1。

图1 免疫组织化学检测CD133和CD44在肾母细胞瘤中的表达(HE×100)

3 讨论

肿瘤干细胞是肿瘤细胞中的一小部分，它具有干细胞的特性(如自我更新)，能够多向分化以及导致肿瘤发生和转移，表达一系列独特的分子标志物(如CD44和CD133)[15]。本研究探讨了2个重要的肿瘤干细胞标志物CD133和CD44在肾母细胞瘤中的表达情况，及其与临床病理参数的相关性。通过免疫组织化学评分分析CD133和CD44在肾母细胞瘤中的表达情况显示，CD133在44%(28/64)的肾母细胞瘤中为阳性，但与CD133相比，CD44在肾母细胞瘤中的阳性率较低，仅为13%(8/64)。与其他肿瘤类似，在肾母细胞瘤中表达CD133的肿瘤细胞数目超过肿瘤干细胞的数目，因此单独检测CD133的表达水平不能用于鉴别肿瘤干细胞。目前，研究人员正试图确定特定的标记或通过一组标志物来定义纯肿瘤干细胞亚群。作为有效的靶向治疗肿瘤干细胞标志物，必须能够识别所有肿瘤细胞且只在肿瘤干细胞上表达[16]。在儿科肿瘤中已经鉴定的肿瘤干细胞标志物数量有限，CD133是常见标志物之一，然而它远非完美的干细胞标志物。此外，在人脑胶质瘤中CD133是生物能量学的压力标志物，在缺氧条件下CD133的表达水平显著增加[17]，但还不能确定增加的C133阳性细胞是来自肿瘤起始亚群还是来自有抗性的细胞群体。

人类肾脏肿瘤发生与器官发育有密切联系[18]。对人胎肾干细胞标志物和肾母细胞瘤中恶性肾干细胞标志物鉴定结果显示，肾母细胞瘤起源于肾干细胞的过度增殖和积累[19]。针对肾母细胞瘤手术切除组织中干细胞标志物的研究[5]显示，其中表达CD133和神经细胞黏附分子(CD56)，表明该肿瘤组织中存在干细胞，克隆形成实验显示，只有表达CD56的细胞具有高克隆形成能力以及过表达肾母细胞瘤预后不良相关基因TOP2A。在肾母细胞瘤中分析CD133的表达水平与肿瘤分期及预后相关性的研究较少。已有研究显示，CD133与儿童肿瘤相关，如骨肉瘤[8]和横纹肌肉瘤[20]；在胶质母细胞瘤中，CD133阳性细胞比例与化疗耐药性有强相关性，因此将CD133作为起源于神经嵴肿瘤的干细胞标志物[21]；在神经母细胞瘤中，CD133的阳性率与肿瘤INSS分期和分化水平低相关[6]；在儿童恶性黑色素瘤中，CD133与肿瘤的侵袭和转移相关[22]。本研究使用CD133作为肿瘤干细胞标志物分析肾母细胞瘤中阳性率达到44%，而且阳性率与肿瘤分期呈正相关。

Balla等[23]研究发现，在视网膜母细胞瘤干细胞样细胞表面表达CD44并广泛参与细胞黏附和迁移等。而且在很多成人肿瘤如乳腺癌、肠癌、胰腺癌和头颈部肿瘤中均显示CD44是肿瘤干细胞标志物[9-12]。本研究结果显示，CD44在肾母细胞瘤中的表达水平低于CD133，因此在肾母细胞瘤中CD44可能不是合适的肿瘤干细胞标志物。为明确CD133和CD44在肾母细胞瘤中是否可以作为肿瘤干细胞标志物，还需要进一步通过流式细胞术从肾母细胞瘤组织中分离CD133或CD44阳性细胞，并鉴定其体外生物学特征。

目前，已从多种儿童肿瘤中鉴定出肿瘤干细胞，但关于儿童肿瘤干细胞的知识相对有限。由于成人和儿童肿瘤干细胞在存在形式、功能和行为方面差异较大，需要找出特定的标志物来识别儿童肿瘤干细胞。本研究发现，CD133可以作为儿童肾母细胞瘤的肿瘤干细胞标志物，其阳性率随着晚期肿瘤分期的提高而增加，这意味着可以通过CD133靶向作用于肿瘤干细胞来治疗儿童难治性或复发性肿瘤。