吉马酮对人大细胞肺癌NCI-H460细胞系增殖、凋亡的影响

张洪海

0 引言

近年来，抗肿瘤新药的研究已经成为肿瘤研究的新热点，其中天然化合物因其高效低毒的特性在肿瘤药物治疗研究中日益受到关注[1-4]。莪术油提取于姜科植物蓬莪术、广西莪术、温郁金的干燥根茎中，目前研究发现，其具有抗病毒、抗炎及治疗溃疡等功效[5-7]。吉马酮(Germacrone)是莪术油的主要有效成分之一，是一种单环倍半萜类天然化合物。近年来的药物研究发现，吉马酮具有明显的抗肿瘤作用，对肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，并且具备低毒高效等特点[8-9]，但其在肺癌中的相关抗肿瘤研究并不多，且抗肿瘤作用机制不完全明确。本研究通过培养人大细胞肺癌NCI-H460细胞进行吉马酮的体外抗肿瘤实验，目的是明确吉马酮对人大细胞肺癌NCI-H460细胞是否有抑制作用，并通过荧光电子显微镜及流式细胞仪等实验研究方法对其抗肿瘤机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 人大细胞肺癌NCI-H460细胞购自中国科学院上海细胞库；吉马酮：中国药品生物制品检定所；RPMI1640培养基及胎牛血清：美国GIBCO公司；0.25%胰蛋白酶：美国康宁公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)：南京凯基公司；二甲基亚枫(DMSO)：南京凯基公司； AnnexinV/PI双染试剂盒：南京凯基公司；流式细胞仪:美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NCI-H460细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37 ℃、饱和湿度、5%二氧化碳的培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长,每48小时胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖 消化并收集对数生长期的NCI-H460细胞，用培养液调整浓度至1×105/ml，96孔板中每孔接种100 μl细胞悬液，待过夜贴壁良好后更换培养液，依次加入含浓度为50、100、200、400 μmol/L吉马酮的培养液，实验同时设有对照组。继续培养24 h后每孔加MTT 20 μl，再培养4 h后吸去培养液，每孔加DMSO 150 μl振荡混匀，酶标仪检测并计算细胞的增殖抑制率，实验重复3次。

1.2.3 荧光显微镜观察NCI-H460细胞形态 消化并收集对数生长期的细胞，用培养液调整浓度至5×105/ml，6孔板中每孔接种2 ml细胞悬液，待过夜贴壁良好后更换培养液，依次加入含浓度为0、400 μmol/L吉马酮的培养液继续培养24 h。PBS洗2次，吹干，固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)固定15 min，PBS洗后加入浓度为5 mg/L的Hoechst 33342溶液1 ml，37 ℃避光15 min，应用荧光显微镜观察并照相，实验重复3次。

1.2.4 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡 消化并收集对数生长期的细胞，用培养液调整浓度至5×105/ml，6孔板中每孔接种2 ml细胞悬液，待过夜贴壁良好后更换培养液，依次加入含浓度为0、200、400 μmol/L吉马酮的培养液继续培养24 h。消化收集细胞后4 ℃、1 000 r/min离心10 min，PBS洗涤离心细胞2次。1×Binding Buffer 500 μl悬浮细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。5 μl AnnexinV-FITC加入细胞悬浮液中混匀，再加入5 μl PI混匀避光15 min，应用流式细胞仪检测细胞凋亡，实验重复3次。

1.3 统计学分析 实验数据应用SPSS 16.0软件进行统计分析，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 吉马酮对NCI-H460细胞增殖的影响 MTT实验显示，吉马酮可以抑制NCI-H460细胞的增殖，并且随着吉马酮浓度的增大对细胞的抑制作用更加明显，呈浓度效应关系(P<0.05)(图1)。

2.2 荧光显微镜观察细胞凋亡改变 荧光显微镜观察结果显示，吉马酮作用组的细胞数量明显减少，细胞核的形态变化显著，出现染色质边集、核碎裂等凋亡改变(图2)。

图1 吉马酮对人大细胞肺癌细胞系NCI-H460细胞增殖的抑制作用

图2 荧光显微镜观察NCI-H460细胞凋亡形态改变

2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡率 流式细胞仪检测结果显示，与对照组相比，随着药物浓度的增大，凋亡细胞的比例逐渐增加，呈现浓度效应关系。见图3。

3 讨论

目前，肺癌仍占恶性肿瘤患者死亡率的首位。近年来，人们采取了化学治疗等来治疗中晚期肺癌，但由于化疗的毒副作用及耐药等问题，对肺癌生存率的提高影响较小[10]。近年来的研究发现，一些天然化合物具有抗肿瘤作用，并表现出低毒高效等特点，目前在肿瘤治疗研究中已受到重视[1-4]。天然化合物的抗肿瘤作用是目前肺癌治疗研究的重要内容之一。

图3 吉马酮诱导NCI-H460细胞凋亡

本研究选取的天然化合物吉马酮是从中药姜科姜黄属植物莪术根茎中提取的天然化学成分，具有抗病毒、抗炎、抗菌等药理作用[11-12]。近年来的药理实验研究发现，吉马酮具有明显的抗肿瘤作用，对肝癌细胞、乳腺癌细胞及胶质瘤细胞等多种肿瘤细胞具有抑制作用，并且具备低毒高效等特点[8-9]。但吉马酮在肺癌中的相关抗肿瘤研究并不多，且抗肿瘤作用机制不完全明确。本研究通过培养人大细胞肺癌NCI-H460细胞进行体外抗肿瘤实验，通过MTT、荧光电子显微镜及流式细胞仪等实验研究方法研究吉马酮对人大细胞肺癌NCI-H460细胞的抑制作用及其抗肿瘤机制。实验结果证明，吉马酮可以抑制人大细胞肺癌细胞系NCI-H460细胞的增殖，并呈浓度依赖关系。荧光显微镜观察到药物作用组细胞核出现染色质边集、核碎裂等凋亡改变，流式细胞仪检测到，随着药物浓度的增加，凋亡率随之增大，证实了吉马酮对人大细胞肺癌细胞有抑制作用，其机制与诱导细胞凋亡有关。

综上所述，吉马酮对人大细胞肺癌NCI-H460细胞有明显的抑制作用，为吉马酮在治疗大细胞肺癌方面提供了部分实验依据，但仍需动物体内实验研究，以进一步评估其体内抗肿瘤效果。