正常小鼠阴道上皮细胞体外原代培养探索

刘燕燕，祁文瑾

女性阴道微生态体系由阴道内的组织结构、微生态菌群，局部内分泌调节功能和免疫功能组成[1]。这是一个非常灵敏的系统,在受到内源性和外源性因素影响时,容易发生改变[2-3]，而导致相关疾病的发生，如细菌性阴道病、外阴阴道假丝酵母菌病和滴虫阴道炎等，由于直接进行患者阴道局部组织取材研究相对困难，利用体外培养的阴道上皮细胞进行相关研究可能更具可行性。该研究旨在探索一种简单有效的正常小鼠阴道上皮细胞体外原代培养技术。

1 材料与方法

1.1主要试剂Epilife Medium、0.06 mol/L氯化钙溶液、HKGS Kit(含胰岛素生长因子-1 5 μg/ml，氢化可的松0.18 mg/ml，牛转铁蛋白2.5 mg/ml，庆大霉素/两性霉素B 1 ml，表皮生长因子200 ng/ml，牛脑垂体提取物24 mg/ml)、DMEM/F12、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均购自美国Gibco公司；0.25%胰酶+0.02%EDTA(美国Gibco公司)；中性蛋白酶Ⅱ(DispaseⅡ，美国Sigma公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，美国Solarbio公司)；100 U/ml青、链霉素(美国Solarbio公司)；兔抗鼠广谱角蛋白抗体 (Rabbit Anti-P-CK,北京博奥森生物技术有限公司)；细胞角蛋白5/6抗体 (CK5/6，上海江莱生物科技有限公司)；10×多聚赖氨酸 (美国Solarbio公司)。

1.2器材LD5-2A高速离心机(北京雷勃尔公司)，3111型CO2培养箱(美国Thermo公司), CK40-F200倒置显微镜(日本OLYMPUS), BHC-1300IIA/B超净工作台(美国Thermo公司)。

1.3实验动物清洁级昆明雌鼠，6～8周，22～28 g，购自昆明医科大学动物实验中心，动物合格证编号：SCXK(滇)K2015-0002。

1.4阴道上皮细胞原代培养小鼠称重记录后，断颈处死，头部向下浸于75%酒精中消毒20 s，防止酒精浸入阴道。在超净台内充分暴露小鼠腹部，沿着双角子宫下端找到阴道，充分剥离周围结缔组织，无菌操作下分别从宫颈口和阴道口处向上5 mm处取1 cm×0.5 cm大小的阴道组织6块，置于6孔板内，分别用4 ℃含双抗的PBS彻底清洗，直至PBS不再浑浊后，将阴道组织转移至新的6孔板内，与2 U/ml的DispaseⅡ 1 ∶2混合，置于4 ℃冰箱过夜。第2天，用眼科镊分离阴道上皮层和固有层，弃固有层，将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1 ∶2的体积比混合，放于37 ℃、5% CO2培养箱内孵育10 min后，用无菌枪头轻轻吹打上皮层30 s后，37 ℃、5% CO2培养箱孵育10 min，再次轻轻吹打上皮层直至在光镜下没有成团的细胞，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，将所得的细胞悬液通过200目尼龙膜过滤，滤液1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入沉淀细胞团体积10倍的PBS 重悬细胞，离心弃上清液，加入Epilife重悬，使细胞密度达到1×105～1×106个/ml，移入25 cm2培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养，2 d后首次换液，以后每2 d换液1次。

1.5传代培养到第7～9天，细胞密度达80%～90%，进行第1次传代，弃培养瓶内培养液，加适量的PBS轻轻吹打瓶底，弃上清液，重复2次，加入0.25%胰酶1 ml浸泡细胞表面，37 ℃培养箱内孵育30 min，光镜下观察，细胞间隙增大，大部分细胞呈圆球形，加入1 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，用无菌枪头轻轻吹打瓶底细胞，将细胞悬液1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入沉淀细胞团体积10倍的PBS重悬细胞，再次离心后，弃上清液，加入与第一次离心时PBS等体积的Epilife重悬，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加2 ml Epilife重悬，以1 ∶2比例转移至新培养瓶内继续培养。

1.6阴道上皮细胞的形态学观察和鉴定

1.6.1光镜下观察阴道上皮细胞生长特征并进行HE染色 取原代生长汇合度将近80%～90%的上皮细胞，胰酶消化后，在预先用多聚赖氨酸处理过的玻片上，制作成细胞爬片, PBS液漂洗，用95%乙醇固定，待干后，苏木精染色5 min，流水洗1 min，75%盐酸乙醇分化10 s，流水洗1 min，伊红染色1 min，酒精梯度脱水，透明后,中性树脂封固,镜检。

1.6.2扫描电镜观察 原代生长汇合度将近80%～90%的上皮细胞，胰酶消化后，在预先用多聚赖氨酸处理过的24孔盖玻片上制作细胞爬片, 用PBS液漂洗盖玻片， 2.5%戊二醛4 ℃固定1 h。PBS液清洗,1%锇酸固定、脱水,真空镀膜仪上干燥后喷金,扫描电镜观察细胞形态及细胞表面情况。

1.6.3免疫组织化学染色 取原代生长汇合度将近80%～90%的上皮细胞，胰酶消化后，在预先用多聚赖氨酸处理过的玻片上，制作细胞爬片，PBS液漂洗，用95%乙醇固定，分别用P-CK、CK5/6抗体进行免疫细胞化学染色,用0.01% PBS漂洗,再以含生物素标记的第二抗体进行反应,DAB显色,苏木精复染,脱水、透明后,中性树脂封固,镜检。

2 结果

2.1阴道上皮原代细胞生长特性观察和HE染色酶消化的原代阴道上皮细胞24 h后大部分贴壁并逐渐伸展，培养7～9 d,汇合度达80%～90%，具有上皮细胞特性：呈多角形,轮廓清晰,折光性强,呈铺路石样生长。见图1。传代后细胞生长较快,4～6 d即可融合。HE染色后，胞质呈红色，细胞核呈蓝色，细胞形态成多角形，呈铺石样生长。见图2。

图1 光镜下不同培养天数原代阴道上皮细胞贴壁情况 ×10

图2 HE染色的第4天原代细胞生长情况

2.2电镜观察扫描电镜下上皮细胞呈镶嵌排列,细胞间界限清楚,表面布满质膜皱褶微绒毛,呈不规则疏网状,称为微绒毛嵴。细胞边缘因对接而增厚,微绒毛嵴则变密变短,形成清楚的分界线。细胞核呈圆形或椭圆形,见图3。

图3 扫描电镜下不同培养天数原代阴道上皮细胞形态

A：原代第2天 ×2 000；B: 原代第4天 ×1 000;C：原代第6天 ×1 000; D：原代第8天 ×300

2.3免疫细胞化学染色经P-CK染色的细胞，胞质呈棕黄色，均为广谱角蛋白阳性细胞，见图4。表明所有细胞均为上皮细胞，少有成纤维细胞污染。经CK5/6染色的细胞，胞质成棕黄色，均为CK5/6阳性细胞，见图5。进一步表明所有细胞均为鳞状上皮细胞。

图4 P-CK染色的细胞

A:光镜下原代细胞第4天 ×40 ;B:光镜下原代细胞第4天 ×20

图5 CK5/6染色的细胞

A：光镜下原代细胞第4天 ×40； B：光镜下原代细胞第4天 ×20

3 讨论

小鼠阴道黏膜由复层鳞状上皮细胞所覆盖，受卵巢雌、孕激素的影响而有周期性变化；雌激素使上皮细胞增生、角化，孕激素使阴道上皮细胞脱落加快。阴道黏膜的基底层细胞具有较强的增殖能力,因此暴露并分离出基底层细胞是一个关键环节。该研究采用的DispaseⅡ是一种中性蛋白酶,可选择性地分解基底膜Ⅳ型胶原和纤维黏连蛋白,不破坏上皮间的细胞连接,与胰酶相比,可以完整的分离阴道上皮层,更好地保留基底细胞层,从而获取更多的增殖细胞[4]。用DispaseⅡ和胰酶分步消化后,阴道上皮细胞24 h后开始贴壁,3～5 d增殖迅速,7～9 d可融合至80%～90%，大大缩短了原代培养的周期。

阴道上皮体外繁殖能力低,对培养环境要求较高,目前报道过的上皮细胞培养基有1640[5]、DMEM+F12[6]、K-SFM[7-10]、DK-SFM[11-12]和Epilife[13]。前两种培养基中都加入了胎牛血清，由于血清促进细胞增殖分化的作用，使细胞易于老化，减少细胞传代次数，使成纤维细胞优势生长，不利于上皮细胞的生长。且需要经过传代1～2次，才能获得纯化高的阴道黏膜干细胞，培养周期长，经济成本大。不少国内外报道[7-9]用K-SFM培养阴道上皮、口腔上皮、牛汗腺等上皮细胞。在本实验的预实验中选用了K-SFM培养基，但近期因国内禁止进口导致货源不稳定而停用，而选用DK-SFM培养，细胞增殖不是很理想，很有可能与该培养基supplement成分中的BPE是人工合成，缺少生物活性有关。Schön et al[13]在培养人宫颈上皮细胞选用Eplife，加用HKGS和0.4 mmol /L氯化钙， Hammiller et al[14]建议在培养小鼠上皮细胞的培养基的氯化钙浓度为0.02～0.09 mmol /L，故该实验取用Eplife加用HKGS和0.02 mmol /L氯化钙获得了纯度高、可传3～4代的阴道上皮细胞。

该实验培养的阴道上皮细胞光镜下呈多角形,大小均一,融合成片后紧密排列如铺路石样,通过扫描电镜从二维视觉动态观察阴道上皮细胞贴壁生长的形态学，随着培养时间延长，由水滴状慢慢延展为多角形，达到接触抑制。细胞表面可见许多微绒毛和脊样胞质皱褶,符合典型的上皮细胞特点。从而提示在酶消化后静置培养箱培养的重要性，让有活力的阴道上皮细胞充分贴壁生长，在培养初期换液需轻柔，而非为了减少成纤维细胞成长过早、过频地吹壁、换液。P-CK和CK5/6免疫细胞化学染色阳性,进一步证实为鳞状上皮细胞。

该实验在对培养基的改良后培养出纯度较高、可传3～4代的阴道上皮细胞，为后期进行女性生殖道微生态系统失调而导致相关阴道感染疾病的研究奠定了良好的基础。