TK1与肿瘤标志物在消化道肿瘤诊断及病理学特征的相关性

江蓓蕾，鲍扬漪，叶 艳

癌症是当今全球严重威胁人类身心健康乃至生命的一种以细胞增殖异常为主要表现的疾病。在过去数十年里肿瘤标志物(tumor marker，TM)一直是肿瘤研究的热点之一。胸苷激酶1(thymidine kinase 1，TK1)是与细胞DNA增殖、合成关系密切的酶，健康人血清中与和非增殖状态下的细胞中含量极低，然而随着恶性肿瘤细胞的快速繁殖，TK1水平会随之同步升高[1]，与全身脏器肿瘤的发生发展及其预后的关系也逐渐受到关注。TK1是嘧啶补救合成途径的关键酶之一，因此可作为一种与肿瘤细胞增殖相关密切的TM。已有大量的研究[2]探讨消化道肿瘤患者TK1与糖类抗原199(carbohydrate antigen 19-9，CA199)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)等TM的血清水平，结果显示肿瘤患者的TK1水平明显高于正常人，在消化道肿瘤的诊断、鉴别诊断、疗效监测和预后评估中有着一定的应用前景。该研究拟进一步探讨血清TK1、CA199及CEA 水平在消化道肿瘤诊断及与其严重程度的相关性，为今后TK1更精准地用于消化道肿瘤诊疗提供依据。

1 材料与方法

1.1病例资料选取合肥市第一人民医院集团医院2015年11月～2017年11月胃癌与结直肠癌147例次病例。所有患者均经影像学、胃镜、肠镜、手术及术后病理确诊，术前均未经其他治疗。其中胃癌76例(男56例，女20例，年龄40～87岁，中位年龄69岁)，结直肠癌71例(男50例，女21例，年龄32～82岁，中位年龄64岁)。选取70例健康体检者作为对照组(男38例，女32例，年龄22～71岁，中位年龄52岁)，所有患者及健康体检者得到本人或其家属的知情同意，并报我院伦理委员会批准。

1.2病理学特征取胃癌与结直肠癌的黏膜组织(一般厚度不超过0.5 cm)投入预先配好的固定液中(10%福尔马林、Bouin氏固定液等)使组织细胞的蛋白质变性凝固。按照以下步骤进行HE染色：组织固定成功后需要修剪25 px*25 px*5 px，放入包埋盒中，流水冲洗(去除组织中的固定液)30 min。至于不同浓度的酒精脱水，一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水分。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块中的酒精，才能浸蜡包埋。将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5～8 μm厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45 ℃恒温箱中烘干，进行HE染色。在镜下分析记录胃癌、结直肠癌的分化程度、浸润深度、肿瘤直径、肿瘤位置、淋巴结转移等病理学指标。

1.3TM检测

1.3.1TK1检测 标本收集: 空腹采集消化道肿瘤患者接受治疗前静脉血2 ml，分别用生化管收集血液，室温待血液凝固，离心分离血清进行TK1检测，方法：3 000～4 000 r/min离心5～10 min，取100～200 μl血清分装于两个洁净的EP管中并编号(一管用于检测、另一管用于复检)，保存在-20 ℃以下待检。检测步骤:根据试剂盒说明书配制pH为7.6抗体稀释液，洗液和封闭剂；根据检测人数选择24或48的硝酸纤维素膜模板，不同浓度的校准品按1号、2号、3号的顺序，点样到A1、A2、A3位置上，待检样品按顺序点在膜上，室温自然晾干20～30 min；在反应盒内用封闭液封闭30 min；加入一抗，25 ℃孵育2 h；用洗涤液漂洗3次，5 min/次；再加生物素化二抗后室温下孵育40 min，洗涤液漂洗3次，5 min/次；按1 ∶10 000稀释链酶亲核素-酶复合物室温孵育1 h，洗涤液漂洗3次，5 min/次；加入ECL发光剂，过膜浸湿并精确反应1 min，将膜片用吸水纸吸干，然后放入塑料膜内挤干剩余的溶液；将膜放入CIS2 I型化学发光成像分析系统内进行分析检测,步骤按照试剂盒说明书执行。

1.3.2CEA、CA125检测 空腹采集消化道肿瘤患者接受治疗前静脉血2 ml，室温自然凝固后，以3 500 r/min离心4 min，分离上清液。采用化学发光免疫分析法检测血清CEA、CA125水平。全自动免疫分析仪(Dxi800)、配套检测试剂盒-癌胚抗原测定试剂盒(化学发光法)、CA199定量检测试剂盒(化学发光法)均购自美国贝克曼公司。

1.4TNM分期TNM分别代表肿瘤浸润胃壁深度、淋巴结转移及远处转移(采用AJCC拟定的胃癌TNM分级与分期系统)。T1：肿瘤浸及黏膜或黏膜下层，T2：肿瘤浸润至肌层或浆膜下，T3：肿瘤穿透浆膜层，但未侵及邻近器官，T4：肿瘤穿透浆膜层，侵及邻近器官。将N0定为无淋巴结转移，N1定为淋巴结转移数目在1～6个，N2转移数为7～15个，N3为16个以上的转移淋巴结，肝十二指肠韧带、胰后、肠系膜和腹主动脉旁远处淋巴结转移。M0：无远处转移；M1：有远处转移。TNM分期中T、N、M确定后就可以得出相应的总的分期，即I期、II期、III期、IV期等。

1.5统计学处理采用SPSS 19.0软件进行分析，数据为计量数据，组内比较采用单因素方差分析(One way Anova)进行检验，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。绘制ROC曲线并计算曲线下面积(area under curve，AUC)。

2 结果

2.1胃癌与结直肠癌肿瘤标志物水平及诊断效能比较各肿瘤标志物组内比较，差异有统计学意义(P<0.01)。结直肠癌CEA、CA199水平与胃癌相比，差异无统计学意义(P>0.05)，胃癌患者TK1水平明显低于结直肠癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。TK1分别与CEA、CA199联合检测以及CEA和 CA199联合检测结果显示，联合检测ROC的 AUC均大于0.7，其中三项指标联合准确性最高，其次是TK1和CA199联合，再次是CEA和CA199联合，最差为TK1与CEA联合。见图1、表2。

表1 胃癌与结直肠癌肿瘤标志物水平比较

与胃癌患者比较：*P<0.05；与结直肠癌患者比较：#P<0.05

图1 联合检查指标血清水平的ROC曲线

表2 TK1、CEA、CA199 联合检测的敏感度、特异度及AUC

2.2不同病理特征胃癌患者的TM水平比较胃癌患者有淋巴结转移、浸润深度深、肿瘤直径大、胃上部及低分化胃癌患者CEA、CA199及TK1水平均明显高于无淋巴结转移、浸润深度浅、肿瘤直径小、胃中下部及高分化(P<0.01)。见表3。

表3 不同病理特征胃癌患者的肿瘤标志物水平比较

与浆膜层、<2 cm、胃上部及低分化比较：*P<0.05；与肌层、2～4 cm及胃中部比较：#P<0.05

2.3不同病理特征结直肠癌患者的TM水平比较不同发病部位的结直肠癌患者三指标水平差异无统计学意义(P>0.05)。其他特征包括浸润深度越大、存在淋巴结转移、管腺癌、肿瘤直径>5 cm及低分化病例，CEA、CA199及TK1水平均明显高于结直肠癌浸润深度浅、无淋巴结转移、粘液腺癌、肿瘤直径≤5 cm及高分化病例(P<0.01)。见表4。

表4 不同病理特征结直肠癌患者肿瘤标志物水平比较

与浆膜层及低分化比较：*P<0.05；与肌层比较：#P<0.05

2.4胃癌与结直肠癌TM与TNM分期的相关性胃癌及结直肠癌患者各肿瘤标志物均随分期的增加而增加，其中胃癌患者TK1水平随TNM分期递增，差异有统计学意义(P<0.05)；结肠癌患者CEA、TK1随TNM分期递增，差异有统计学意义(P<0.05)，同时各分期组间TK1水平差异亦有统计学意义(P<0.05)。见表5。

3 讨论

基因型的标志物异常主要见于癌变前阶段或肿瘤早期，可作为肿瘤易感性和早期筛查的工具。至今TM仍未有统一的分类规范，TM检测的主要意义仍是：肿瘤筛查、辅助诊断、疗效观察和预后判断[3-5]。

表5 胃癌与结直肠癌TM与TNM分期的相关性

与胃癌、结直肠癌I期比较：*P<0.05；与胃癌、结直肠癌Ⅱ期比较：#P<0.05；与胃癌、结直肠癌Ⅲ期比较：△P<0.05

TK1属于催化胸腺嘧啶核苷转化为单磷酸胸腺嘧啶的重要酶，其含量和肿瘤DNA的合成呈正相关性[6]。健康成人血清及组织TK1水平极低，而恶性肿瘤患者，TK1水平随肿瘤细胞增殖速度而升高，超出正常人群水平的2～100倍，TKl水平升高和肿瘤细胞增殖状态关系密切。因此血清学TK1水平的检测可作为动态观察体内肿瘤细胞增殖的指标。Zou et al[7]提出TK1可作为一种潜在的TM用于胃癌等消化道癌症的术后评估。Huang et al[8]对 8 135例受试者进行血清TK1检测，89.2%的血清TKl水平升高人群存在癌前病变或早期癌症的风险，因此TK1可作为可靠的筛查指标。Xu et al[9]对1 068人次的多分组研究表明血清 TK1 能够作为较好的诊断恶性肿瘤的指标。Chen et al[10]对1 247例临床癌症患者进行研究，结果显示TK1水平与临床分期关系密切，可用于疗效预测。目前研究多聚焦在TK1在肿瘤的早期诊断及临床分期的应用，TK1联合检测及病理分期在消化道肿瘤的研究方面甚少。本研究通过检测胃癌和结肠癌患者外周血TK-1水平，结果显示：胃癌患者血清中TK1水平与其发病部位相关，以胃上部及低分化胃癌患者TK1水平升高较为明显，而且其水平也与胃癌病理学特征-转移、浸润及瘤体大小相关，差异有统计学意义；结直肠癌患者血清中TK1水平与其结直肠癌病理学特征-转移、浸润及瘤体大小等标志水平相关，差异有统计学意义；胃癌患者中TK1表达水平明显低于结直肠癌患者。本研究所纳入病理特征体现了肿瘤的侵袭性，一定程度提示TK1不仅与肿瘤细胞增殖相关，也与肿瘤侵袭性相关。

本研究还比较了TK1、CEA、CA199三联和CEA、CA199二联的检测数据，发现TK1、CEA、CA199三联准确性更高。胃癌患者TK1水平随着TNM分期的递增而升高，且结直肠癌患者伴随分期的递增较胃癌更为显著。本研究纳入例数有限，侧面反映了TK1无论在恶性病变的联合诊断还是在严重程度评估中均具有显著优势。

1965年Gold et al[11]首次发现了CEA。CEA水平的明显增高主要见于74%的结肠癌、90%的胰腺癌患者。CA199也在消化系统多数肿瘤中作为标志物之一，正常人血清含量极微；患有肝胆、胰腺癌和胃肠道肿瘤时患者血中的CA199水平可显著升高，其中胰腺癌阳性率为85%～95%,胆管癌和胆囊癌为85%左右,直肠癌为30%～50%[12-13]。因此，CA199可作为胰腺癌和消化道癌症的主要筛查指标。本研究结果显示胃癌患者CEA及CA199水平的表达也与胃癌病理学特征-转移、浸润及瘤体大小呈正相关性。

综上所述,CEA、CA199及TK1水平均与胃癌及结直肠癌的发病、病理特征及TNM分期有着密切关系，三者联合可有效提高消化道肿瘤的诊断效能，血清水平越高，病理特征恶性程度越高，TNM分期更高。胃癌患者TK1表达水平高于结直肠癌患者，TK1水平在消化道肿瘤之间也存在一定差异，TK1用于消化道肿瘤筛查时，可帮助医师初步判断病变位置以便有针对性地进行进一步检查，TK1水平与TNM分期更为密切，因此TK1在消化道肿瘤诊断及严重程度判断中更有前景。