桦褐孔菌乙酸乙酯部位化学成分及体外抗肿瘤活性研究

吴泽华，程文明,2，张致勇，缪忆如，李春如

桦褐孔菌(Inonotusobliquus)又名白桦茸，是锈革孔菌科、褐卧孔菌属的药用真菌。主要分布在俄罗斯(西西伯利亚、堪察加半岛)、北美、波兰、芬兰、日本(北海道)以及中国吉林省(长白山)、黑龙江、内蒙古(大兴安岭)。在民间拥有广泛的应用基础，用于治疗多种癌症(肝癌、胃癌、肠癌等)、糖尿病、心脏病,并且能抑制病毒等。相关文献[1]资料显示，该菌还有多种活性成分，主要含有多种三萜和甾醇类化合物。近代药理学研究表明桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物具有较强抗肿瘤活性。为了明确桦褐孔菌药效的物质基础，对其进行提取分离，并将得到的单体化合物进行初步的抗肿瘤活性筛选，为更进一步开发桦褐孔菌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1药材与瘤株桦褐孔菌产于吉林省抚松县，经浙江泛亚生命科学研究院李春如教授鉴定，存放于安徽医科大学药学院天然药物化学实验室。人胃癌SGC-7901、肝癌HepG2及神经胶质瘤U-87细胞由安徽医科大学药学院提供。

1.2仪器与试剂AVANCE 500型超导核磁共振光谱仪(瑞士Bruker公司，内标为四甲基硅烷)；LC-8A制备液相色谱仪(日本岛津公司)； 6210 TOF LC-MS 液质联用仪(美国Agilent公司)；2306-Z CO2培养箱(美国)；uQuant全波长酶标仪(美国Biotek公司)。HPD100大孔树脂(河北宝恩公司)；薄层色谱GF254 硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公司)；柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)；小孔树脂MCI(日本Mitsubishi Chemical公司)；SephadexLH-20 (瑞典GEHealthcare Bio-Sciences公司)；氘代试剂(美国Sigma公司)；甲醇、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇(西陇化工股份有限公司，为分析纯)；DMEM培养基(美国Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物材料研究所)；胰酶(上海碧云天生物技术研究所)；PBS(武汉博士德生物科技有限公司)；DMSO、MTT(美国Sigma公司)；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)(上海汉博生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1分离提取 将8 kg桦褐孔菌干粉用10倍量95%乙醇，60 ℃提取4遍，每次12 h，过滤，合并药液并减压浓缩(温度不超过60 ℃) 药膏至没有醇味，得到浸膏。加适量水使其混悬，分别用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，依次浓缩回收萃取液，得乙酸乙酯萃取物(FA)180 g。对乙酸乙酯部位(FB)(160 g)进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇50 ∶1、30 ∶1、15 ∶1、5 ∶1、1 ∶1梯度洗脱，通过薄层色谱(TLC)跟踪合并相同流份，得到9个部分A1～A9。A2经MCI(甲醇-水1 ∶9～10 ∶0)，得A2-1～A2-8，A2-2经反复硅胶柱色谱(氯仿-甲醇50 ∶1)得3个部分(A2-2-1～A2-2-3)，A2-2-2经制备液相(甲醇-水1 ∶4～1 ∶1)纯化得化合物1(54 mg)。A2-3经SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～甲醇)、硅胶柱(氯仿-甲醇15 ∶1)得到化合物2(25 mg)。A2-7经SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、制备液相(甲醇-水3 ∶7～1 ∶1)纯化得到化合物3(21 mg)。A1经MCI(甲醇-水1 ∶9～10 ∶0)，得A1-1～A1-13。A-11经SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、硅胶柱(氯仿-甲醇25 ∶1)得到化合物4(13 mg)。A1-3经SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、制备液相(甲醇-水2 ∶3～7 ∶3)纯化得到化合物5(3.7 mg)。A1-6经硅胶柱(氯仿-甲醇50 ∶1，石油醚-丙酮15 ∶1)得到化合物6(21 mg)。A1-10经MCI(甲醇洗脱)、硅胶柱(石油醚-丙酮50 ∶1)得到4个部分(A1-10-1～A1-10-4)，A1-10-1经硅胶柱(石油醚-丙酮80 ∶1)SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)得到化合物7(10.5 mg)。A1-10-3经制备液相(甲醇-水2 ∶3～7 ∶3)纯化得化合物8(12 mg)。A5经MCI(甲醇-水1 ∶9～10 ∶0)得5个部分(A5-1～A5-5)。A5-5经SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)得5个部分(A5-5-1～A5-5-5)，A5-5-3经硅胶柱(氯仿-甲醇20 ∶1)、制备液相(甲醇-水1 ∶1～2 ∶1)纯化得化合物9(4.5 mg)、化合物10(10.5 mg)。A1-6经硅胶柱(氯仿-甲醇20 ∶1洗脱)、SephadexLH-20凝胶柱(甲醇-水1 ∶4～10 ∶0)、制备液相(甲醇-水1 ∶1～4 ∶1)纯化得到化合物11(3.4 mg)、化合物12(4.5 mg)。

1.3.2结构鉴定 分析所得化合物的核磁共振碳谱(nuclear magnetic resonance carbon spectrum，13C-NMR)、核磁共振氢谱(nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1H-NMR)和高分辨率质谱(high resolution mass spectrometer，HRMS)数据，与文献比对确定化合物结构。

1.3.3抗肿瘤活性单体化合物筛选 三种细胞用含10%热灭活的胎牛血清DMEM高糖培养基，于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养。设空白对照组、化合物不同浓度组(200、100、50、25、12.5 μmol/L)及阳性药物组(5-FU，200、100、50、25、12.5 μmol/L)。取对数生长期细胞(5 000个/孔)接种于96孔板中，细胞贴壁后按上述分组加入相应化合物，每个浓度5个复孔，空白对照组加入相同体积培养基。细胞培养48 h后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，培养4 h后弃去上清液，每孔加入150 μl的DMSO，振荡10 min后用酶标仪(492 nm)检测吸光度。实验重复3次。

2 结果

2.1结构鉴定

2.1.1化合物1 灰白色粉末，熔点(melting point，mp)153～154 ℃, HRMS质荷比(m/z)137.02 [M-H]-。1HNMR (CD3OD): 7.09 (d, J=1.8 Hz, H-2), 6.80 (d, J=7.6 Hz, H-5), 9.57 (s, -CHO);13C-NMR (CD3OD): 130.8 (C-1), 115.3 (C-2), 147.1 (C-3), 153.7 (C-4), 116.2 (C-5), 126.4 (C-6), 193.1 (C-7)。以上数据与文献[2]相关数据对照基本一致，故确定化合物1为原儿茶醛。

2.1.2化合物2 橘黄色粉末，mp.177～179 ℃。HRMS m/z: 201.05 [M+Na]+。1HNMR (CD3OD): 2.32 (3H, s, H-1), 6.53 (1H, d, J=16.2 Hz, H-3), 7.51 (1H, d, J=16.2 Hz, H-4), 7.00 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J=8.1 Hz, H-9) , 6.97 (1H, dd, J= 8.1, 2.1 Hz, H-10);13C-NMR (CD3OD): 27.5 (C-l), 201.6 (C-2), 123.5(C-3), 146.9 (C-4), 127.6 (C-5), 116.0 (C-6), 147.3 (C-7), 150.4 (C-8), 117.1 (C-9), 124.6 (C-10)。以上数据与文献[3]相关数据对照基本一致，故确定化合物2的结构为4-(3，4-二羟苯基)-3-丁烯-2-酮。

2.1.3化合物3 黄色片状结晶(乙醇)，mp.196～197 ℃。HRMS m/z: 252.04 [M-H]-。 1HNMR (CDCl3): 12.15(1H, s, 8-OH), 12.04(1H, s, 1-OH), 7.05(1H, s, H-2), 7.26(1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, H-7), 7.60(1H, s, H-4), 7.64(1H, t, J=8.0 Hz, H-6), 7.76(1H,t, J=8.0, 2.0 Hz, H-5), 2.45(3H, s, CH3);13C-NMR (CDCl3):162.7 (C-1), 124.3 (C-2), 132.9 (C-3), 124.0 (C-4), 113.6 (C-5), 149.1 (C-6), 115.8 (C-7), 162.4 (C-8), 192.5 (C-9), 182.0 (C-10), 133.2 (C-4a), 119.2 (C-8a), 120.4 (C-9a), 137.2 (C-10a)。分子质量为254，推测其分子式为C15H10O4。在1HNMR中，12.15、12.04为醌环上的两个羟基信号，2.45为醌环上甲基信号，7.05-7.76为醌环上氢信号。13C-NMR中192.5、182.0为9、10号碳的信号峰，与文献[4]对照，确定为大黄酚。

2.1.4化合物4 白色粉末，mp.134～135 ℃。HRMS m/z: 684.84 [M]+。1HNMR (CD3OD): 5.10 (1H, br, t, J=8.9 Hz, H-2′), 3.90 (2H, overlapped, H-3, H-4), 3.82 (1H, m, H-5), 3.60 (1H, dd, J=8.9 Hz, H-1B), 3.52 (1H, dd, J=8.9 Hz, H-1A) , 3.30 (1H, m, H-2), 1.24 (br.s, CH2-chain), 0.69 (6H, t, H-18, H-24′);13C-NMR (CD3OD): 175.2 (C-1′), 130.0 (C-2′), 73.5 (C-4), 71.2 (C-3), 69.6 (C-5), 60.2 (C-1), 50.2 (C-2), 31.7 (C-6), 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.0 (C-chain), 27.6, 26.5, 25.6, 22.7, (C-17), 14.0 (C-18)。以上数据与文献[5]对照基本一致，故确定化合物4为Coelarthenol。

2.1.5化合物5 无色油状物，易溶于氯仿、甲醇等有机试剂。HRMS m/z : 301.14 [M+Na]+。1HNMR (CD3OD): 7.72 (2 H, dd, J=6.0, 3.3 Hz, H-3, H6), 7.60 (2 H, dd, J=6.0, 3.3 Hz, H-4, H-5), 4.27 (4 H, t, J=6.6 Hz, H-8, H-8′), 1.71 (4 H, m, H-9, H-9′), 1.42 (4 H, m, H-10, H-10′), 0.97 (6 H, t, J=7.1 Hz, H-11, H-11′-CH3);13C-NMR (CD3OD): 133.5 (C-1), 133.5 (C-2), 130.0 (C-3), 132.3 (C-4), 132.3 (C-5), 129.8 (C-6), 169.4 (C-7, 7′), 66.7 (C-8, 8′), 31.7 (C-9, 9′), 20.2 (C-10, 10′), 14.0 (C-11, 11′)。以上数据与文献[6]报道一致，故鉴定化合物5为邻苯二酸二正丁基酯(1，2-benzenedi-carboxylic acid dibuty ester)。

2.1.6化合物6 白色针状晶体，mp.258～260 ℃。HRMS m/z : 455.35 [M-H]-。HNMR (CD3OD) δ: 0.65 (3H, s, H-18), 0.71 (3H，s:H-19), 0.82 (3H, s, H-28) ，0.91 (3H, s, H-30), 0.92 (3H, s, 3H) 为5个高场区的角甲基尖峰，这为四环三萜类化合物的典型结构特征，1.52 (3H, brs, H-26), 1.64 (3H, brs, H-27) 是两个烯丙位的甲基峰，3.02 (1H, m, J=10.0, 5.1, 5.0 Hz, H-3), 4.34 (1H, d, J=5.1Hz, 3-OH), 5.05 (1H，t，J=7.0 Hz, H-24), 12.05 (1H, s, COOH)。13C-NMR (CD3OD): 177.0 (C-21), 134.2 (C-8), 133.3 (C-9), 131.1 (C-25), 123.8 (C-24), 76.7 (C-3), 49.9 (C-5), 48.9 (C-14), 47.4 (C-17), 46.5 (C-20), 43.7 (C-13), 38.5 (C-4), 36.5 (C-10), 35.1 (C-1), 32.2 (C-15), 29.9 (C-16), 28.3 (C-2), 28.0 (C-7), 27.5 (C-29), 26.4 (C-22), 25.9 (C-12), 25.5 (C-23), 25.4 (C-26), 24.0 (C-30), 20.2 (C-11), 18.9 (C-6), 17.8 (C-19), 17.4 (C-27), 15.8 (C-18), 15.60 (C-28)。以上数据与文献[7]对照基本一致，故确定化合物6为栓菌酸。

2.1.7化合物7 无色油状液体，有果香，mp.55 ℃。1HNMR (CD3OD): 1.32 (3H, t, J=7.2 Hz, H-3″), 1.78 (6H, t, J=7.2 Hz, H-7, 7′), 2.76 (2H, d, J=15.2 Hz, H-3), 2.94 (2H, d, J=15.2 Hz, H-3′), 4.10 (4H, q, J=7.2 Hz, H-6, 6′), 4.21 (2H, q, J=7.2 Hz, H-2″), 4.93 (1H, -OH);13C-NMR (CD3OD): 13.1 (C-7, 7′), 13.2 (C-3′′), 43.2 (C-3, 3′), 60.4 (C-6, 6′), 61.5 (C-2″), 73.2 (C-2), 170.0 (C-1), 173.2 (C-4, 4′)。以上数据与文献[8]对照一致，由此确定化合物7为柠檬酸三乙酯。

2.1.8化合物8 无色细针状结晶，mp.228～230 ℃。HRMS m/z: 429.29[M-H]-。1HNMR (CD3OD): 0.61 (s,3H), 0.81 (d, 3H, J=7.0 Hz), 0.81 (d, 3H, J=7.0 Hz), 0.88 (d, 3H, J=7.0 Hz), 0.97 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.01 (s, 3H), 1.97 (m,1H), 3.50 (m, 1H, H-6T), 3.92 (m, 1H, H-3T), 5.14 (dd, 1H, J=10.0, 2.0 Hz), 5.17 (dd, 1H, J=10.0, 2.0 Hz), 5.22 (m, 1H);13C-NMR (CD3OD): 143.7 (C-8), 137.2 (C-22), 133.3 (C-23), 119.1 (C-7), 77.1 (C-5), 74.2 (C-6), 68.4 (C-3), 57.4 (C-17), 55.9 (C-14), 44.7 (C-9), 44.6 (C-24), 44.2 (C-4), 41.7 (C-20), 40.5 (C-12), 40.4 (C-20), 38.2 (C-10), 34.7 (C-2), 33.9 (C-25), 31.6 (C-1), 30.7 (C-16), 24.1 (C-15), 23.5 (C-11), 21.7 (C-26), 20.6 (C-21), 20.4 (C-27), 18.9 (C-19), 18.6 (C-28), 12.5 (C-18)。以上数据与文献[9]对照基本一致，故确定化合物8为(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇。

2.1.9化合物9 无定形粉末。HRMS m/z: 295.08 [M-H]-。1HNMR (CD3OD): 7.31 (1H, s), 4.58 (1H, overlapped) , 4.21(H, dd, 6.3, 7.7 Hz), 3.84 (6H, s), 3.82 (1H, dd, J=3.5, 11.0 Hz), 3.60 (1H, dd, J=3.5, 11.0 Hz), 3.00 (1H, m);13C-NMR (CD3OD): 125.8 (C-1), 106.6 (C-2), 147.7 (C-3), 141.8 (C-4), 147.8 (C-5), 106.6 (C-6), 195.7 (C-7), 43.6 (C-8), 68.0 (C-9), 176.5 (C-10), 45.7 (C-11), 58.9 (C-12), 56.2 (-OCH3)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物9为白木香素A(AquilarinA)。

2.1.10化合物10 无色油状物，易溶于氯仿、丙酮，难溶于甲醇。HRMS m/z: 301.14 [M+Na]+。1HNMR (CDCl3): 0.95 (3H, overlapped, H-4″), 0.94 (3H, overlapped, H-4′), 0.98 (3H, overlapped, H-3″), 1.46 (2H, m, H-3′), 1.72 (2H, m, H-2′), 2.05 (1H, m, H-2″), 4.09 (2H, d, J=8.0 Hz, H-1″), 4.32 (2H, m, H-1′), 7.52 (2H, m, H-3, 5), 7.72 (2H, m, H-2, 6);13C-NMR (CDCl3): 132.2 (C-1), 130.8 (C-2, 6), 128.8 (C-3, 5), 132.1 (C-4), 167.7 (C-7, 7′), 65.6 (C-1′), 30.5 (C-2′), 19.2 (C-3′), 13.7 (C-4′), 71.8 (C-1″), 27.7 (C-2″), 19.1 (C-3″, 4″)。通过波谱数据分析并与文献[11]比较，鉴定化合物10为 1， 4-benzenedicarboxylic acid 1-butyl-4- (2-methylpropyl) ester。

2.1.11化合物11 无色针晶(甲醇)，mp.142～146 ℃，HRMS m/z: 437.19 [M+K]+。1HNMR (CDCl3): 0.56 (3H, s, H-8), 0.91 (3H, d, H-7), 0.93 (3H, d, H-6), 0.95 (3H, d, H-1), 1.02 (3H, d, H-8), 1.30 (3H, s, H-9), 3.52 (1H, m, H3), 5.34 (1H, d, H-7), 5.41 (2H, m, H-2, H-23);13C-NMR (CDCl3): 37.2 (C-1), 31.5 (C-2), 71.8 (C-3), 38.0 (C-4), 40.2 (C-5), 29.5 (C-6), 117.4 (C-7), 139.4 (C-8), 34.5 (C-9, C-10), 21.4 (C-11), 39.3 (C-12), 43.5 (C-13), 55.1 (C-14), 23.2 (C-15), 27.9 (C-16), 55.9 (C-17), 11.6 (C-18), 13.0 (C-19), 40.6 (C-20), 21.3 (C-21), 132.3 (C-22), 135.7 (C-23), 39.6 (C-24), 33.2 (C-25), 19.7 (C-26), 20.3 (C-27), 18.2 (C-28)。以上数据与文献[12]对照基本一致，故确定化合物11为3β-羟基-(22E，24R)-麦角甾-7，22-二烯。

2.1.12化合物12 白色粉末，mp.168～169 ℃。HRMS m/z: 684.64[M]+。1HNMR (CDCl3): 0.54 (3H, s, H-18), 0.77 (3H, d, H-28), 0.79 (3H, d, H-26), 0.80 (3H, s, H-19), 0.84 (3H, d, H-27), 0.90 (3H, d, H-21), 3.62 (1H, m, H-3), 5.14 (1H, m, H-7);13C-NMR (CDCl3): 139.4 (C-8), 117.4 (C-7), 71.0 (C-3), 56.0 (C-17), 55.0 (C-14), 49.4 (C-4), 43.2 (C-13), 40.2 (C-5), 39.5 (C-12), 39.1 (C-24), 38.3 (C-4), 37.4 (C-1), 36.6 (C-20), 34.2 (C-10), 33.5 (C-22), 31.5 (C-2), 31.4 (C-25), 30.5 (C-23), 29.6 (C-6), 27.9 (C-16), 22.5 (C-15), 21.5 (C-11), 20.5 (C-26), 19.5 (C-21), 17.6 (C-27), 15.5 (C-28), 13.0 (C-19), 11.8 (C-18)。以上数据与文献[13]对照基本一致，故确定化合物12为(24S)-Ergost-7-en-3β-ol。

2.2抗肿瘤活性测试MTT法测分离得到的单体化合物对肿瘤细胞增殖能力的影响，结果表明化合物2、6、8有较强的抑制肿瘤细胞增殖的作用，且呈现浓度依赖关系，其IC50值如表1所示。

表1 部分单体化合物对肿瘤细胞抑制效应的IC50值

3 讨论

从天然产物尤其是真菌中筛选抗肿瘤活性物质是研发抗肿瘤新药的一个重要方向。查阅相关文献及国内外诸多研究结果显示，桦褐孔菌提取物具有较强抗肿瘤活性，主要通过抗有丝分裂及抑制蛋白质的生物合成影响肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡。也有部分研究者认为其多糖类物质可以激活机体免疫系统从而发挥抗肿瘤作用。目前对桦褐孔菌中发挥抗肿瘤活性的单体研究较少，且与其活性相关的质控成分尚不完整，需进一步完善。

课题组前期对桦褐孔菌各部位提取物进行了活性筛选，发现石油醚萃取物以及乙酸乙酯萃取物具有明显的体内外抗肿瘤活性，但对其化学成分以及发挥效应的成分尚不明确。本文在课题组前期试验基础上，采用多种分离纯化手段，从桦褐孔菌乙酸乙酯萃取物中分离纯化出12个已知单体化合物，查阅文献显示，其中化合物2和化合物9为首次从该菌中分离得到。对部分化合物进行了体外抗肿瘤活性研究，化合物2、6、8具有较强抗肿瘤活性，其中化合物2对胃癌SGC-7901和神经胶质瘤细胞U-87有较强抗肿瘤活性(IC50值分别为25.37、33.34 μmol/L)，化合物6对SGC-7901、HepG2及U-87三种细胞均有较强抗肿瘤活性(IC50值分别为23.95、82.15、31.89 μmol/L)，化合物8对胃癌SGC-7901细胞有较强抗肿瘤活性(IC50值为50.08 μmol/L)。

综上所述，本文通过对桦褐孔菌抗肿瘤活性单体的分离、结构鉴定及抗肿瘤活性研究，为深入探索桦褐孔菌抗肿瘤细胞作用机制提供了科学依据。