流行于我国的优势基因型弓形虫株毒力及其棒状体蛋白ROP5和ROP18蛋白序列差异分析

徐 婷，王 聪，罗庆礼，沈继龙

刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种全球广泛传播的机会致病性原虫，人类感染弓形虫主要通过经口食入未煮熟的含包囊(cyst)的动物肉类，食入被猫粪中的卵囊(oocyst)污染食物或饮水，以及母婴先天性垂直传播三个途径[1]。近年来研究表明，世界各地分离的弓形虫株基因型具有丰富的遗传多态性和地域差异[2]，流行于我国的弓形虫株优势基因型为Chinese 1型(即ToxoDB#9型)[3]，且种群内存在有2个毒力不同的虫株：TgCtwh3(以下简称Wh3)和TgCtwh6(以下简称Wh6)。该文通过对Wh3和Wh6虫株的毒力研究，比较ROPs家族毒力相关分子ROP5和ROP18的基因序列差异，为深入探讨我国优势基因型弓形虫株的毒力效应分子多态性与虫株致病性的关系具有重要理论和实际意义。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物和参考虫株 5～6周龄雌性SPF级BALB/c小鼠40只，4～6周龄昆明鼠60只，均购自安徽省实验动物中心，室温下标准饲养。弓形虫虫株Wh3型、Wh6型、RH株(ToxoDB#10型，传统的Ⅰ型虫株)和PRU株(ToxoDB#1型，传统的Ⅱ型虫株)由安徽省人兽共患病重点实验室保种传代。

1.1.2主要试剂和仪器 DNA提取试剂盒及PCR预混液购自生工生物工程(上海)有限公司；琼脂糖为西班牙GENE公司产品；PCR纯化试剂盒购自美国Axygen公司；基因扩增引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。温度梯度基因扩增仪、电泳仪和电泳槽均为美国BIO-RAD公司产品；凝胶成像系统为江苏省捷达科技发展有限公司产品。

1.1.3引物 根据通用的弓形虫ME49虫株GenBank中ROP5基因(GenBank：XM 002371884.2)和ROP18基因(GenBank：XM 002367716.1)序列，设计PCR扩增引物，分别扩增2个基因的全长序列。引物序列见表1，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 ROP5和ROP18基因全长引物序列

1.2方法

1.2.1弓形虫株Wh3和RH株的速殖子的获取 从液氮中取出保种的弓形虫Wh3和RH株速殖子，腹腔注射接种于4～6周昆明鼠下腹部，接种后密切观察小鼠进食水及精神状态，当小鼠出现发病症状后，麻醉断颈处死小鼠，抽取腹水并按照本实验室的常规方法[4]，PBS洗涤3次后经梯度离心法纯化并收集速殖子，立即进行后续的毒力实验，并-80 ℃保存备用。

1.2.2弓形虫株Wh6和PRU株的速殖子的获取 实验室弓形虫Wh6和PRU虫株保种于慢性感染的昆明鼠，在脑组织中形成包囊。麻醉断颈处死保种小鼠，取鼠脑加无菌PBS匀浆，离心取匀浆沉淀收集包囊并计数，腹腔接种昆明鼠包囊200个/只，待小鼠急性感染发病时，麻醉处死小鼠，收集腹水，同样纯化并收集Wh6和PRU虫株的速殖子，获取的速殖子立即进行后续的毒力实验，并-80 ℃保存备用。

1.2.3虫株RNA提取与总cDNA制备 分别取上述方法收集的速殖子，PBS重悬洗涤，加入1 ml TRIzol，冰上反复吹打裂解常规方法提取总RNA，按Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明，制备cDNA，-20 ℃保存备用。

1.2.4虫株的毒力检测 将上述收集纯化后速殖子经PBS稀释至2 ml置显微镜下计数，按1×103个/只分别腹腔感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠，每个虫株各感染10只。逐日观察各组小鼠的状态并计算死亡率和存活时间；若实验小鼠长期存活，则至感染后45 d，麻醉颈椎脱臼处死各组存活小鼠，脑组织压片观察包囊是否形成。累积死亡率(%)=死亡小鼠个数/感染小鼠个数×100%。

1.2.5毒力相关和成囊相关基因分析 以上述4个虫株制备的cDNA为模版，分别扩增ROP5和ROP18基因全长。PCR反应体系：弓形虫cDNA模板2.0 μl，2×PCR Taq预混液25.0 μl，上游引物(10 μmol/L)1.0 μl，下游引物(10 μmol/L)1.0 μl，无核酶水补至总体系50.0 μl。ROP5扩增条件：94 ℃预变性5 min，接着94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；ROP18退火温度为60 ℃，其余条件同ROP5。PCR结束后，1%琼脂糖凝胶观察反应结果。扩增产物纯化后，送生工生物工程(上海)有限公司进行测序，将测序结果分别由核苷酸序列转换为氨基酸序列，使用Clustal X软件进行序列比对分析，分别比较2个毒力因子氨基酸序列在4个虫株中的差异。

1.3统计学处理采用SPSS 13.0软件进行统计分析。根据BALB/c小鼠和昆明鼠感染不同弓形虫株的存活时间、死亡率，采用χ2检验比较小鼠感染各虫株反应有无差异；不同虫株两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1虫株毒力分别取4个虫株1×103个速殖子经腹腔接种BALB/c小鼠后，第5天开始，感染WH3和RH株的BALB/c小鼠出现竖毛、腹水、抽搐等明显症状，至第7天完全死亡；昆明小鼠腹腔接种同样数量WH3和RH株弓形虫速殖子后，存活时间略长于BALB/c小鼠，但在12 d之内亦全部死亡。感染后小鼠生存曲线如图1所示，在感染同一品系小鼠后，两虫株之间的毒力差异无统计学意义(χ2=0.4303、1.511，P>0.05)。而同一虫株感染两个品系小鼠时，昆明小鼠存活时间明显长于BALB/c小鼠(P<0.01)，表现出同一虫株对不同品系的小鼠有着不同的毒力,见表2。而分别感染WH6和PRU虫株的BALB/c小鼠和昆明小鼠均全部存活至45 d，在这些长期存活的BALB/c小鼠和昆明小鼠脑内，均检出WH6和PRU虫株的包囊。

2.2毒力相关和成囊相关基因扩增结果通过PCR扩增4株弓形虫棒状体蛋白家族的毒力和成囊相关分子ROP5和ROP18，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果显示：4株弓形虫ROP5基因分别扩增出略小于2 000 bp的目的片段，与预期的1 650 bp大小一致；ROP18基因分别扩增出略小于2 000 bp的目的片段，与预期的1 665 bp大小一致。见图2。

2.3基因比对结果分析上述4株弓形虫ROP5和ROP18基因扩增产物测序结果，分别转换为氨基酸序列后的序列比对分析。图3所示，4株弓形虫ROP5和ROP18氨基酸序列进化树，ROP5氨基酸序列上，WH3株和Wh6株亲缘关系更近，而ROP18氨基酸序列上，WH3株和RH株亲缘关系更近。序列比对结果发现，WH3株的ROP5氨基酸序列与RH株和PRU株的一致性(identity)分别为96.2%(528/549)和96.7%(531/549)，ROP18分别为95.8%(531/554)和99.1%(549/554)；WH6株ROP5氨基酸序列与RH株和PRU株的一致性分别为97.8%(542/554)和98.2%(544/554)，ROP18分别为95.8%(531/554)和99.1%(549/554)。WH3株和WH6株在ROP5和ROP18氨基酸序列上，均与PRU株更为接近，与RH株差异较多。

3 讨论

传统生物学的分类标准中弓形虫属下仅包含一个种Toxoplasmagondii。目前世界各地从动物体和人体分离的弓形虫株逐渐增多，通过对这些虫株的生物学性状研究表明，各分离虫株的生活史完全相同，虫体在各个生活史阶段(包括速殖子、包囊、卵囊等)的形态特征也完全相同。各弓形虫株唯一的区别是毒力上的差异，表现为弓形虫感染小鼠的致死率各不相同。是何种原因所致这种现象，一直是国内外学者近年来研究的热点。

表2 BALB/c小鼠和昆明小鼠分别感染4种弓形虫株后的存活时间比较

图1 BALB/c小鼠和昆明小鼠分别感染弓形虫WH3和RH株后的生存曲线

图2 琼脂糖凝胶电泳分析ROP5和ROP18基因PCR产物

A：PCR扩增ROP5基因片段；B：PCR扩增ROP 18基因片段；M：DNA Marker；1：WH3株；2：WH6株；3：RH株；4：PRU株

图3 4株弓形虫ROP5和ROP18氨基酸序列进化树

欧美国家的学者按照虫株的毒力不同，将弓形虫简单划分Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，各包含着多个虫株，且感染小鼠分别为“强毒”、“弱毒”和“无毒”。随着多位点PCR-RFLP技术的应用，选用10个分型的遗传标志，将这些虫株分成了更为详细的基因型，建立了弓形虫基因型数据库(ToxoDB)。传统的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分别为ToxoDB#10型、ToxoDB#1型和ToxoDB#2型。随着弓形虫基因型研究的深入，发现世界各地弓形虫株具有丰富的遗传多态性[2]。而国内其他学者以及本实验室的研究均显示，流行于中国的弓形虫株以Chinese 1型(ToxoDB#9)为其优势基因型，具有有限的遗传多态性[5-6]。同时本实验室通过RFLP分型和微卫星分型均显示，Chinese 1基因型虫株中存在2个分离株WH3和WH6，其毒力和致病性有着明显的差异[3-4,6]。这种差异也对传统的观点提出了挑战，是何种因素导致这种差异在同一种基因型弓形虫株中存在，一直是我们重点关注和深入研究的关键问题。

近年来一系列的研究[7]表明，不同基因型弓形虫株入侵宿主细胞的过程以及对感染小鼠的毒力存在显著差异，弓形虫入侵宿主细胞过程中及定居在宿主细胞内，所分泌的包括ROPs、GRAs、MICs、RONs等多种效应分子蛋白，是这些差异产生的主要原因。ROPs效应分子蛋白是由弓形虫棒状体(rhoptry)细胞器分泌，在虫体感染宿主细胞以及诱导宿主免疫应答，甚至感染结局等方面起到关键的作用。ROPs具有多态性[8-9]，其中ROP5、ROP16和ROP18等弓形虫效应蛋白分子研究较多。本实验室利用CRISPR-Cas9技术敲除弓形虫RH株ROP16后发现，虫株毒力无明显变化，提示ROP16在弓形虫毒力方面非核心分子[10]。

ROP5和ROP18均为ROP2家族的成员[11]。既往的研究可知，ROP5作为ROP18必备的辅助因子，通过强化免疫相关GTP 酶(immunity-related GTPases，IRGs)的非活化表型来阻止IRGs与GTP结合[12-13]。ROP18是虫株多态性丝/苏氨酸激酶，ROP18遗传序列差异决定了其毒力的差异，Ⅰ型虫株ROP18可使所有品系的小鼠均致死，而Ⅱ型和Ⅲ型比较弱[14]，将Ⅰ型虫株的ROP18转基因至Ⅲ型虫株，则出现毒力增强，证实ROP18是弓形虫株毒力的主要决定因素之一[15]。那流行我国的优势基因型Chinese 1型(ToxoDB#9)弓形虫的两个虫株为何具有不同的毒力和致病性，其ROP5和ROP18有何差异，是本次研究的重点内容。

本次的研究显示，WH3虫株的ROP5基因型和ROP18基因型与毒力较弱的II型虫株差异较小，而与毒力较强的I型虫株差异较大，表明我国流行的优势基因型弓形虫株的毒力相关分子与传统基因型存在差异，也说明若仅仅以一种或少数几种毒力分子的遗传序列来判断弓形虫株的毒力具有明显欠缺之处。