褪黑素对PDGF-BB激活的HSCs自噬作用的研究

揭 磊，洪汝涛，张玉洁

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是肝脏对多种慢性损伤后的共同病理阶段，最终发展为肝硬化甚至肝癌[1-2]。目前临床上尚无很有效治疗措施。研究[3]表明，肝纤维化是可以逆转的。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSCs)在肝纤维化发展中起到关键作用[4]。研究[5]表明，PDGF是最强致炎因子之一，PDGF-BB及其受体在HSCs激活中起到关键作用。自噬是一种代谢过程，可维持细胞正常功能。研究[6]表明，自噬可激活HSCs，导致肝纤维化。褪黑素是松果体分泌的一种活性物质。课题组前期研究[7-9]表明褪黑素对四氯化碳所致肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路及抑制HSCs的增殖有关。该课题通过研究HSCs自噬水平及褪黑素干预，进一步探究褪黑素抗纤维化作用。

1 材料与方法

1.1实验细胞及试剂HSCs系(HSC-T6)(南京凯基生物科技发展有限公司)；褪黑素(美国Sigma公司)；PDGF-BB(美国PeproTech公司)；DMEM高糖培养基(南京Wisent生物公司)；胎牛血清(杭州四季青生物公司)；MTT(美国Sigma公司)；抗α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；抗Beclin1抗体、抗微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain-3,LC3)抗体(美国Abcam公司)；抗β-actin 抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)；DMSO、PMSF、青霉素/链霉素、胰酶消化酶、BCA试剂盒、PVDF膜(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.2细胞培养HSC-T6细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内培养，每隔24 h换液，待细胞融合至70%～80%时传代，并取对数生长期细胞进行相关实验。按实验需求，将细胞分为5组，即：模型组及实验组(3组)加入PDGF-BB(10 ng/ml)[10]，实验组分别加入不同浓度的褪黑素(1 nmol/L、 1 μmol/L、0.1 mmol/L)。对照组加入等量PBS。

1.3MTT实验取对数生长期HSC-T6细胞，经胰酶消化后，置于DMEM重悬，调整细胞浓度为5×103个/孔，接种于96孔板内，每孔200 μl。分为5组：对照组、模型组、实验组(褪黑素1 nmol/L、1 μmol/L、0.1 mmol/L组)，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱内培养24 h后，更换为无血清培养基培养，除对照组外，其余各组均加入PDGF-BB(10 ng/ml)作用30 min，后在实验组分别加入相应浓度的褪黑素，对照组加入等体积的PBS。药物作用48 h后弃去上清液，加入MTT(5 mg/ml)作用4 h。后弃去上清液，每孔加入150 μl DMSO,将96孔培养板置于摇床上震荡10 min，用酶标仪检测490 nm波长处各孔吸光度(optical density，OD)值。

1.4Westernblot实验取对数生长期HSC-T6细胞消化后接种于培养瓶，恒温培养箱内培养24 h后，除对照组外，其余各组均加入PDGF-BB(10 ng/ml)作用30 min，在实验组加对应浓度的褪黑素，对照组加等体积PBS。作用48 h后提取总蛋白，利用BCA法予以蛋白定量，取10 μl样品上样电泳，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移到PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h ，用PBS洗5 min×3次，加抗α-SMA、Beclin1、LC3、血小板衍生生长因子受体-β(platelet derived growth factor receptor-β,PDGFR-β) 一抗(1 ∶2 000)，抗β-actin一抗(1 ∶3 000)，置于4 ℃冰箱过夜，次日室温孵育30 min后用PBST洗涤 10 min ×3 次，加二抗(1 ∶80 000)，室温孵育1.5 h后，用PBST洗涤 10 min ×3 次，加ECL显色液显影。β-actin 作为内参，用IPWIN 6.0软件分析结果，蛋白表达水平以目的蛋白/β-actin的平均灰度比值表示。

2 结果

2.1褪黑素对PDGF-BB激活的HSC-T6细胞增殖的影响MTT结果显示，与对照组相比，PDGF-BB激活了HSCs，促进其增殖，差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，褪黑素可抑制HSCs的增殖。见表1。

表1 褪黑素对PDGF-BB激活的HSC-T6细胞增殖的影响

与对照组比较:**P<0.01;与模型组比较:##P<0.01

2.2褪黑素对HSC-T6细胞α-SMA表达的影响Western blot结果显示，相对于对照组，PDGF-BB激活的HSC-T6细胞α-SMA表达水平增高，差异有统计学意义(F=13.954，P<0.05)；而相对于模型组，褪黑素可降低HSC-T6细胞α-SMA的表达(F=13.954，P<0.05)。见图1。

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素1 nmol/L组；D：褪黑素1 μmol/L组;E:褪黑素0.1 mmol/L组；与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01

2.3褪黑素对HSC-T6细胞Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达的影响Western blot结果显示，在PDGF-BB激活的HSC-T6细胞中，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白表达水平相对于对照组明显增加(F=6.205、48.283，P<0.05)；相对于模型组，在褪黑素干预的各治疗组中，Beclin1蛋白和LC3Ⅱ蛋白表达显著减低(F=6.205、48.283，P<0.05)。见图2。

2.4褪黑素对HSC-T6细胞PDGFR表达的影响Western blot结果显示，在PDGF-BB激活的HSC-T6细胞中，PDGFR表达相对于对照组显著增高(F=18.848，P<0.01)；相对于模型组，褪黑素干预的HSC-T6细胞中，PDGFR表达明显降低(F=18.848，P<0.05)。见图3。

3 讨论

肝纤维化是肝脏受到慢性损伤时产生多种炎症介质，激活HSCs，产生大量细胞外基质的病理过程。该过程中，肝实质细胞被纤维组织所替代，最终发展为肝硬化，甚至肝癌，严重威胁人类健康。相关研究[3]表明，肝纤维化发生发展过程中，经适当的干预，其病理过程可被阻止，甚至逆转。因此，积极开发安全有效的抗肝纤维化药物有重要的临床意义。

图2 褪黑素对Beclin1蛋白及LC3Ⅱ蛋白表达的影响

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素1 nmol/L组；D：褪黑素1 μmol/L组;E:褪黑素0.1 mmol/L组；与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01

褪黑素具有抗炎抗氧化作用，同时也有抗纤维化作用。Lebda et al[11]结果显示，褪黑素可抑制炎症介质的分泌、对抗氧化应激、抑制纤维化进程等，从而起到抗肝纤维化作用。González-Fernández et al[12]研究表明，褪黑素具有抗纤维化作用，可能与抑制鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信号通路有关。此外，本课题组前期研究[7-9]表明，褪黑素具有抗纤维化作用，可能与其抗氧化、抑制TGF-β/Smad信号通路有关。本实验通过体外培养HSCs，以PDGF-BB激活及褪黑素干预，通过MTT法及Western blot法检测HSCs增殖、激活及其自噬表达水平，结果表明，褪黑素可抑制HSCs增殖及激活，可能是通过抑制HSCs内自噬水平发挥作用。

HSCs是一种间质细胞，存在于肝脏狄氏间隙。正常情况下，HSCs处于静止状态；但当肝脏受到损伤产生炎症介质时，如TGF-β、PDGF等，HSCs被激活，转化为肌成纤维样细胞(myofibroblast cells,MFC),分泌大量细胞外基质，进而促使肝纤维化的发展。其中，α-SMA是HSCs激活的标志。目前，一些研究将抑制HSCs的激活作为抑制肝纤维化的靶点。本实验结果表明褪黑素可能通过抑制HSCs的激活和增殖发挥抗肝纤维化作用。

图3 褪黑素对PDGFR蛋白表达的影响

A：对照组；B：模型组；C：褪黑素1 nmol/L组；D：褪黑素1 μmol/L组;E:褪黑素0.1 mmol/L组；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01

自噬是广泛存在于人体的一种代谢过程。人体的衰老细胞器、内膜等被自噬体吞噬，转运至线粒体，维持细胞新陈代谢。有研究[13]表明，自噬可促进HSCs的激活，导致肝纤维化。静息状态下，HSCs中含有大量脂滴及维生素A，为HSCs未被激活的标志。而在HSCs被激活时，细胞内的自噬体可吞噬脂滴，转运至线粒体进行β氧化，为HSCs的活化及其分泌大量胶原蛋白等提供能量。Shen et al[14]试验结果表明，虾青素可抑制HSCs的活化，其作用机制可能与虾青素抑制HSCs内自噬的水平有关。本实验结果表明，褪黑素可能通过抑制HSCs内自噬水平从而抑制其激活及增殖。

在HSCs激活过程中，PDGF-BB/PDGFR-β信号通路扮演重要角色。PDGF-BB与其受体PDGFR-β结合，启动该信号通路，诱导肝纤维化的发展。且在慢性肝损伤中，PDGF-BB 和 PDGFR-β的表达相对于正常肝组织明显增加[15]。有研究[10]表明，PDGF-BB能激活HSCs并促进其增殖。本实验结果表明，褪黑素干预可能通过抑制PDGF-BB/PDGFR-β信号通路而抑制HSCs激活及增殖。

综上所述，本实验利用PDGF-BB激活HSCs，结果显示，PDGF-BB能激活HSCs、促进其增殖，该作用可能与PDGF-BB启动PDGF-BB/PDGFR-β信号通路，上调HSCs的自噬水平有关；而褪黑素可抑制HSCs的激活及增殖，其机制可能与褪黑素抑制PDGF-BB/PDGFR-β信号通路，进而抑制HSCs内自噬水平有关。这为肝纤维化的治疗提供新的思路。