莱茵衣藻IFT25的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

王 震 ， 董 彬 ， 樊振川 ，2，3， 孟德梅 *，2，3

（1.天津科技大学 教育部食品营养与安全重点实验室，天津 300457；2.天津市食品营养与安全和药物化学联合实验室，天津300457；3.天津科技大学 新农村发展研究院，天津 300457）

纤毛是存在于细胞表面具有运动或感知功能的细胞器，多项研究报道，纤毛的结构或功能障碍会导致许多疾病[1-4]，如多囊肾病、视网膜变性、慢性呼吸疾病、脑积水和不孕等。为了预防和治疗这些疾病，许多研究者对纤毛内各种蛋白质组分、结构及其作用机理进行了大量研究[5-7]。纤毛的运动和感知是由马达蛋白、IFT颗粒、BBS等元件来维持的，其中IFT颗粒是维持纤毛功能所必须的[8]。研究表明，IFT颗粒包含至少20种蛋白质组分，这些组分形成一个复合物整体，可以运送细胞体内蛋白质进出纤毛[9]。IFT颗粒中蛋白质组分的构象改变或缺失将会引起纤毛的组装和功能障碍[4，6]。

IFT颗粒包含IFT-A和IFT-B复合物，两者分别包含6种和14种组分，还有一些新成员将不断被发现[8，10]。IFT颗粒的各个组分在各个物种间几乎呈高度保守性，但是在秀丽隐杆线虫和果蝇中却没有发现IFT-B复合物的组分IFT25，暗示着IFT25可能区别于其他常规的IFT-B复合物组分，在纤毛运输系统中发挥特殊的作用[10]。在莱茵衣藻中研究发现，IFT25是一种磷酸化蛋白质，可以和IFT27结合，促进IFT27的稳定性和可溶性，说明两者可能有功能上的关联[11]。在小鼠中研究发现，IFT25缺陷型不出现纤毛结构和长度的明显变化，说明IFT25不参与纤毛的组装，但是发现其在维持Hedgehog信号正确传导中发挥作用。同时在小鼠的研究中，IFT25缺陷型细胞中没有发现有丝分裂缺陷，这可能表明哺乳动物中不需要IFT25调控细胞周期[12]。目前关于IFT25的作用机制尚不清晰，因此深入研究模式生物莱茵衣藻中IFT25在纤毛组装、纤毛内物质运输及信号传导中的作用机制具有重要意义。

制备特异性和灵敏性的莱茵衣藻IFT25抗体，是顺利完成IFT25在蛋白水平表达模式、以及IFT25与其他蛋白质互作机制研究的重要前提。作者虽在2009年对莱茵衣藻IFT25和IFT27的互作进行了详细研究[11]，但是至今没有商品化的莱茵衣藻IFT25抗体可供研究者使用，也没有关于莱茵衣藻IFT25抗体制备方法的报道。作者采用经济和简单的方法，以原核表达莱茵衣藻IFT25为抗原制备兔源多克隆抗体，并运用多种方法进行抗体纯化以提高抗体的特异性，从而为全面阐明IFT25在纤毛中的具体作用机制及理解纤毛相关疾病的致病机理奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌 XL1-blue，BL21（DE3） 感受态，pGEX-2T-ift25-lcc-his-ift27 质粒：均为作者所在实验室保存；莱茵衣藻cc125藻种：作者所在实验室保存。

1.1.2 主要试剂DNA Marker（1 000 bp、100 bp）、dNTPs：购自全式金公司；T4DNA连接酶、Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶（BamH I、Hind III）、彩色预染蛋白Marker、IPTG：购自 Fermentas公司；质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：均购自索莱宝公司；引物合成和基因测序：由北京奥科鼎盛公司完成；HRP标记的山羊抗兔IgG：购自康为世纪；Dextrin SepharoseTMHigh Performance、Ni SepharoseTM6 Fast Flow、Protein ASepharoseTM：购自 GE 公司。

1.1.3 实验动物新西兰大白兔2只，8周龄大，体重1.5～2.0 kg，由天津欧阳实验种兔场提供。

1.2 方法

1.2.1 原核表达载体构建实验室保存的pMAL-c2X 和 pET-28a（+）表达载体用 BamH I、Hind III进行双酶切，并进行切胶回收；以表1中设计的引物PCR扩增出ift25，用BamH I、Hind III进行双酶切，产物纯化回收目的基因；将目的基因分别与两个载体用T4DNA连接酶连接后，转化到大肠杆菌XL1-blue 中，分别涂到含氨苄青霉素（120 μg/mL）、卡那霉素（30 μg/mL）的LB平板上筛选阳性菌落；挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，酶切和测序验证。

表1 扩增ift25所用引物序列Table 1 Sequences of the PCR primers for the gene of ift25

1.2.2 重组质粒在大肠杆菌中诱导表达验证将正确重组质粒用热激法转化到大肠杆菌BL21中，在分别含氨苄青霉素（120 μg/mL）和卡那霉素（30 μg/mL）的LB平板上筛选含pMAL-c2X-ift25和pET-28a（+）-ift25阳性菌落；挑取阳性菌落过夜培养，然后按照5%接种体积分数分别转接到5 mL含氨苄青霉素（120 μg/mL）和卡那霉素（30 μg/mL）的LB培养基中，37℃、200 r/min培养至 OD600值到0.6～0.8， 加入终浓度 0.2 mmol/L的 IPTG，25℃、180 r/min诱导表达6 h，收集菌体进行SDS-PAGE分析[13-14]。

1.2.3 融合蛋白MBP-IFT25的纯化将含pMAL-c2X-ift25重组质粒的大肠杆菌BL21经过诱导表达后，超声波破碎菌体细胞，离心收集上清液。含融合蛋白上清液用Dextrin SepharoseTMHigh Performance进行亲和纯化，纯化条件为：结合缓冲液 A（20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% β-巯基乙醇，pH 7.4）， 洗脱缓冲液 A（20 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1% β-巯基乙醇，10 mmol/L 麦芽糖，pH 7.4），将洗脱出的蛋白质样品进行SDS-PAGE分析[15]。

1.2.4 融合蛋白6×His-IFT25的纯化含pET-28a（+）-ift25重组质粒的大肠杆菌BL21经过诱导表达后，菌体细胞进行超声波破碎，离心收集包涵体。包涵体用洗涤液缓冲液 （50 mmol/L Tris，100 mmol/L NaCl，1 mol/L 尿素，1%TritonX-100，pH 8.0）洗涤 3次后，然后用变性缓冲液 （20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿素，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 进行变性溶解。融合蛋白在变性条件下用Ni SepharoseTM6 Fast Flow进行亲和纯化，纯化条件为：结合液缓冲液B（20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L 尿 素 ，500 mmol/L NaCl，pH 7.4），分别用含有 60、100、300 mmol/L 咪唑的洗脱液缓冲液B （20 mmol/L NaH2PO4，8 mol/L尿素，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 进行梯度洗脱，洗脱出的蛋白质样品进行SDS-PAGE分析[16-17]。

1.2.5 多克隆抗体的制备取两只8周大的新西兰大白兔，在实验室适应一周后准备免疫。初次免疫前在耳源静脉取血，分离血清，在后续试验中作为阴性血清；初次免疫，取2 mg MBP-IFT25与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，在兔子颈背部选多点皮下注射；10～14 d后进行加强免疫，取2 mg MBPIFT25与等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化，在兔子颈背部多点皮下注射；之后每次加强免疫前耳源取血，ELISA测定抗血清的效价，当效价满足试验要求，加强免疫后一周取血分离抗血清[18-20]。

1.2.6 ELISA测定抗血清效价酶标板每孔包被1 μg融合蛋白MBP-IFT25，0.5%的脱脂奶粉封闭，抗血清和阴性血清设定稀释梯度为 1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000，二抗为辣根过氧化物酶（HPR）标记的山羊抗兔 IgG（1∶20 000），TMB（3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺）显色后测定OD450，抗血清OD450/阴性血清OD450≥2.0为阳性，其最高稀释倍数为抗血清的效价[19]。

1.2.7 抗血清的纯化分离完的抗血清用Protein A SepharoseTM进行纯化，纯化条件为：结合缓冲液C（12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0），洗脱缓冲液C（0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.7），流速 0.5 mL/min。收集吸收峰对应的洗脱液，用1 mol/L Tris-HCl（pH 9.0）将洗脱液pH值调至中性。Protein ASepharoseTM纯化完的抗体用硝酸纤维素膜亲和法[21]进一步纯化，将6×His-IFT25经过SDS-PAGE和电印迹转移到硝酸纤维素膜（PVDF）上，丽春红染色后剪下目的条带，5%脱脂奶粉封闭后与经过Protein A SepharoseTM的抗体4℃结合过夜，用洗脱缓冲液C进行洗脱，收集洗脱液并将pH值调至中性。

1.2.8 Western blotting检测多克隆抗体的特异性莱茵衣藻cc125接种到Tris-Acetate-Phosphate（TAP）[22]培养基中室温光照培养 3 d，取 1 mL加入离心管中，2 000 r/min离心5 min，弃去上清液；向沉淀中加入54 μL Buffer A （工作浓度0.1 mol/L的Na2CO3）和 6 μL DTT（1 mol/L），涡旋振荡器振荡 5 s重悬衣藻细胞；向离心管中继续加入40 μL Buffer B（5%SDS、30%蔗糖），室温振荡 45 min；10 000 r/min离心5 min，收集上清液。取4 μL衣藻上清液加入1 μL 5×上样缓冲液混匀，进行SDS-PAGE和电转印后，衣藻蛋白转移到PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭；多克隆抗体稀释度1：1000，二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG（1：5000），加入显色液后曝光压片显色或曝光照相[20]。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建及鉴定

两套重组质粒进行双酶切验证，结果见图1。两套重组质粒均获得了570 bp的片段，并将重组质粒送到金唯智公司测序，测序引物选择通用引物，经过对比序列完全正确，说明表达载体构建成功，将其分别命名为 pMAL-c2X-ift25 和 pET-28a（+）-ift25。

图1 重组质粒的双酶切验证Fig.1 Double enzyme verification of recombinant plasmid

2.2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及融合蛋白的可溶性分析

pMAL-c2X-ift25和 pET-28a （+）-ift25均转化到大肠杆菌BL21中。含pMAL-c2X-ift25的菌体经过IPTG诱导，SDS-PAGE在60 000处出现目的条带，而未经诱导的含重组质粒的菌体蛋白没有此带，说明目的MBP-IFT25成功表达；将诱导完的菌体经过超声破碎，目的条带主要出现在上清液中，而沉淀中则几乎没有，说明融合蛋白呈水可溶性，见图2。含pET-28a（+）-ift25的菌体经过IPTG诱导，SDS-PAGE在20 000附近出现目的条带，而未经诱导的空白对照则没有此带，说明6×His-IFT25成功表达，而且主要分布在沉淀中，说明6×His-IFT25主要以包涵体形式表达。这与之前报道相同，即MBP对融合蛋白有促水溶作用[14]；本试验中6×His与IFT25融合表达时融合蛋白的水溶性较差。

图2 SDS-PAGE检测重组表达载体pMAL-c2X-ift25和pET-28a（+）-ift25 在 E.coli BL21（DE3）中的表达及融合蛋白的可溶性Fig.2 SDS-PAGE analyzed the expression of recombinant vector pMAL-c2X-ift25 and pET-28a（+）-ift25 in E.coli BL21 （DE3） and the solubility of fusion protein

因为呈水溶型的目的蛋白可以保持蛋白质的天然构象，制备的抗体可以更特异性的结合目的蛋白，包涵体在变性溶解、复性操作后可以恢复蛋白质的天然构象，但是在提高复性效率上存在诸多难度和挑战，而且不能达到完全复性。因此，作者选择呈水溶性的MBP-IFT25作为免疫动物的抗原；包涵体6×His-IFT25则用于抗体的膜纯化[21]。

2.3 融合蛋白的纯化

融合蛋白MBP-IFT25和6×His-IFT25经过亲和纯化后，用SDS-PAGE进行分析，见图3。结果表明两个融合蛋白的相对分子质量正确，且经灰度分析（SAGECREATION凝胶成像仪）表明，两者纯度均达90%以上。

图3 MBP-IFT25和6×His-IFT25的亲和纯化Fig.3 Affinity purification of MBP-IFT25 and 6×His-IFT25

2.4 ELISA测定抗血清效价及多克隆抗体的特异性检测

融合蛋白MBP-IFT25作为抗原免疫两只新西兰大白兔，用ELISA测定免疫过程中的抗血清效价，结果在第四次免疫后12 d，两只兔子的抗血清效价均超过1 280 000，见图4，满足试验要求，于第五次免疫后一周取血分离抗血清。

图4 间接ELISA法测定抗血清的效价Fig.4 Results of ELISA test of anti-IFT25 polyclonal antiserum

取兔子1抗血清首先经过Protein A纯化，结果见图5，再进行抗原-抗体膜纯化。用Western blotting检测其识别莱茵衣藻中IFT25的特异性，经过显色可以在20 000附近识别出单一条带，条带相对分子质量大小符合预期，见图6，即制备的多克隆抗体可以特异性识别IFT25，可以直接用于后续对IFT25的研究。

图5 Protein A纯化IFT25的抗血清Fig.5 Anti-IFT25 was purified by protein A

图6 Western blotting分析IFT25多克隆抗体的特异性Fig.6 Western blotting analysis of the specificity of IFT25polyclonal antibody

3 结 语

IFT25作为纤毛内运动蛋白IFT复合物B中的一个重要组分，在纤毛运动和感知中的作用机制仍不清晰。制备特异性和灵敏性的IFT25抗体，来检测其在模式生物莱茵衣藻中的表达模式及与其他IFT成员的互作机制是阐明IFT25在生物体内作用机制的重要方式。作者成功构建了MBP-IFT25和6×His-IFT25两种融合蛋白，亲和纯化后蛋白质纯度超过90%。并用水溶性的MBP-IFT25融合蛋白作为抗原制备其多克隆抗体，ELISA测定效价超过128 000。依次经Protein A和硝酸纤维素膜纯化制备的抗体，用Western blotting检测具有很好的特异性，能够正确的特异性识别莱茵衣藻中的IFT25蛋白质，表明所制备的IFT25抗体可以直接用于ELISA、Western blotting及活体中的检测，为IFT25作用机制的阐明和纤毛相关疾病的诊断提供了重要理论和方法支持。