荧光猝灭法研究二氢槲皮素和二氢杨梅素与牛血清白蛋白的相互作用

2018-11-06樊超钟艺青粟芸李会娟吴方评金苹

安徽医药 2018年11期

樊超，钟艺青，粟芸，李会娟，吴方评，金苹

(湖南医药学院，湖南怀化 418000)

二氢槲皮素别名花旗松素、紫杉叶素、黄杉素、双氢栎精，是药用植物中存在的一种重要的二氢黄酮醇类化合物，属于维生素PP族。研究表明，二氢槲皮素具有抗肿瘤[1-3]、抗氧化[4-5]、抗病毒[6-7]和抗心血管系统疾病等生物活性作用，在药品、保健品、食品、烟草等行业中有广泛的应用。二氢杨梅素也是一种重要的二氢黄酮醇类化合物，研究表明，其具有抗肿瘤[8-10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、解酒护肝[13]、抗病原微生物[14]、降血糖[15]、抗疲劳和调血脂等方面的作用。两种二氢黄酮醇的结构非常相似(图1)，本实验拟用光谱法研究二氢槲皮素和二氢杨梅素与血清白蛋白(BSA)作用机制，以了解它们在人体内的储存、转运、代谢等情况，同时对两种二氢黄酮醇的深入开发也具有重要意义。

注：A为二氢槲皮素；B为二氢杨梅素

图1两种成分的化学结构图

1 材料与方法

1.1仪器与试剂荧光分光光度计F-7000(日本日立公司)；UV-4802型紫外分光光度计(UNIC公司)；牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，相对分子量65 000)5.0 ×10-5mol·L-1(即称取约0.032 5 g BSA晶体溶于二次蒸馏水并定容至10 mL)，使用前配成1×10- 6mol·L-1；二氢槲皮素 (贵州迪大生物有限公司，纯度≥98%，批号：GZDD-0121)使用前用无水甲醇配成1×10-6、2×10-6、3×10-6、4×10-6、5×10-6、6×10-6、7×10-6、8×10-6、9×10-6、10×10-6mol·L-110种不同浓度的溶液；二氢杨梅素(贵州迪大生物有限公司，纯度≥98%，批号：480-18-2)使用前用无水甲醇配成0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、5.4×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6、8.1×10-6、9.0×10-6mol·L- 110种不同浓度的溶液；0.1 mol·L-1(pH=7.3)Tris-HCl缓冲溶液；0.5 mol·L-1NaCl水溶液；实验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水(电导率1.7 mS·cm-1)。

1.2实验条件的优选(1)BSA的浓度范围：实验表明BSA浓度在1.20 ×10-7～2.00 ×10-6mol·L-1范围内，荧光强度与其浓度成正比，故实验中BSA浓度选择1.0 ×10-6mol·L-1；(2)缓冲介质的选择：测试了BSA在Tris-HCl、Na2B4O7-H3BO3和Na2HPO4-NaH2PO4三种缓冲溶液中的荧光稳定情况，发现BSA在Tris-HCl缓冲溶液中稳定性较好，因而选定Tris-HCl作为实验的缓冲作用溶液；(3)pH 的影响：在Tris-HCl缓冲溶液中，pH于4.0～9.0范围内测定BSA的荧光光谱，发现pH在6.0～7.5范围内BSA荧光强度相对稳定，所以选择与人体体液相近的pH=7.3;(4)离子强度的影响：NaCl浓度在0.10～0.35 mol·L- 1范围内对BSA荧光强度影响不太明显，因而实验选定0.10 mol·L- 1的NaCl溶液作为测定BSA荧光时的离子强度。

1.3荧光光谱的测定在选定条件下， 10支10 mL比色管中分别加入1 mL Tris-HCl缓冲液、1 mL 0.5 mol·L-1的NaCl溶液、1 mL二次蒸馏水、0.1 mL 5×10-5mol·L-1BSA溶液和不同浓度的二氢黄酮溶液，用甲醇定容至5 mL，将比色管分别置于18、25、30 ℃的水浴锅中反应5 min，设定激发狭缝宽度为2.5 nm、发射狭缝宽度为5 nm，扫描速度为1 200 nm·min-1，在激发波长为280 nm的激发下，于290～450 nm范围内扫描，分别得到二氢槲皮素和二氢杨梅素的荧光猝灭光谱(见图2和图3)。

2 结果

2.1荧光光谱的研究在BSA中，由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三种芳香族氨基酸的存在，故使BSA存在内源荧光，而色氨酸的荧光强度大于其他两种，所以BSA荧光强度的变化可直接反映色氨酸残基及其周围环境的变化。以不同浓度的二氢槲皮素和二氢杨梅素与BSA的作用体系来看，随着两种二氢黄酮浓度的增加，在341 nm左右两种体系的荧光发射强度均出现有规律的被猝灭现象，且最大发射波长均有一定程度的蓝移情况。说明两种小分子二氢黄酮醇引入后与BSA发生了结合反应，并生成了荧光较弱或不发荧光的物质。

2.2荧光猝灭类型的判断荧光的猝灭类型分为动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭可用动态猝灭常数Ksv来描述猝灭剂与荧光物质之间的相互作用的程度及性质；静态猝灭可用静态结合常数K来描述猝灭剂与荧光物质之间相互作用的程度和性质。

激发态时猝灭剂与荧光物质分子之间的相互作用过程可通过动态猝灭得到反映，其作用规律遵循Stern-Volmer方程:

F0/F=1+KQτ0CQ=1+KsvCQ

式中：F0为未加入猝灭剂时荧光物质的荧光强度；F为猝灭剂浓度等于CQ时荧光物质的荧光强度；KQ为双分子猝灭过程的速率常数；τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命;Ksv为Stern-Volmer双分子猝灭速率常数，看作是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比率。

静态猝灭则可认为是基态时猝灭剂与荧光物质生成荧光较弱或不发荧光的复合物，可用下列方程来描述：

F0/F=1+KCQ

式中：K为基态复合物的形成常数。

从温度影响、荧光寿命和吸收光谱等三方面判断猝灭类型：(1)温度影响:静态猝灭时，分子复合物的稳定性随温度的升高而下降，因而猝灭常数随温度的升高而减小；动态猝灭时，温度升高，扩散系数增大，双分子的猝灭常数增大，因而动态猝灭与温度有关。(2)荧光寿命：静态猝灭不因为猝灭剂的存在而影响荧光分子激发态的寿命，因而τ0/τ=1；动态猝灭因为猝灭剂的存在而使荧光寿命缩短，此时τ0/τ=F0/F。(3)吸收光谱：静态猝灭因形成分子复合物而使吸收光谱发生变化；动态猝灭不改变荧光物质的吸收光谱，只影响荧光物质的激发态。

本实验采用Stern-Volmer方程进行处理，以方便判断猝灭类型，F0/F=1+KQτ0CQ=1+KsvCQ以F0/F对CQ作曲线图(图4)，数据结果见表1。

从图4可以看出，F0/F对CQ呈现良好的线性关系，且曲线的斜率随着温度的升高而逐渐降低，可判断两种小分子二氢黄酮醇与BSA结合形成了复合物，应为静态猝灭过程。

文献[16]报道，各类猝灭剂对生物大分子的碰撞猝灭常数约为2×1010L·mol-1·s-1，荧光寿命约为1×10-8s。从实验结果看，两种小分子二氢黄酮醇对BSA的猝灭常数都远远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数，进一步表明两种二氢黄酮醇对BSA的猝灭属于静态猝灭。

2.3结合常数的计算静态猝灭过程中荧光强度F、猝灭剂浓度CQ和结合常数K之间的关系可用Line Weaver-Burk双倒数函数表示：

(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1CQ-1

通过(F0-F)-1对CQ-1作曲线图(图5)，可求得二氢槲皮素和二氢杨梅素与BSA作用的结合常数，具体数据见表2。

从表2可以看出，温度对二氢槲皮素及二氢杨梅素与BSA的结合常数K的影响不大，K的数值均大于104，说明BSA与两种二氢黄酮结合较强，而相同的温度下二氢杨梅素的结合常数K较大，可能与二氢杨梅素的结构B环上多一个羟基有关，进而说明黄酮中的羟基参与了结合反应。

2.4作用力类型的确定不同药物小分子与大分子蛋白质的作用力类型主要有氢键、范德华力、疏水作用力和静电引力等。如温度变化不大，反应焓变ΔH可看成常数，作用力类型可以通过反应前后热力学参数焓变ΔH和熵变ΔS的大小进行判断。药物小分子与大分子BSA之间作用的热力学参数可表示为：

lnK2/K1=ΔH(1/T1-1/T2)/R

ΔS=-(ΔG-ΔH)/T

ΔG=ΔH-TΔS

通过选定T1=293 K，T2=303 K计算其热力学参数，具体数据见表3。

表3 BSA与二氢槲皮素和二氢杨梅素结合的热力学参数

从表3的热力学数据来看，二氢槲皮素和二氢杨梅素的吉布斯自由能ΔG<0，说明两种二氢黄酮与蛋白质BSA的结合反应是自发进行的；ΔS>0，ΔH<0，说明两者的结合力主要为疏水作用；二氢槲皮素和二氢杨梅素为多羟基类化合物，羟基将参与成键，因此除了疏水作用外，应该还有氢键作用，两种小分子物质极有可能扦插到BSA中形成疏水空腔而使BSA的荧光发生猝灭。