新型硫化氢供体GYY4137对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用

2018-11-06胡丽饶婷段丹段菲黄焱琼蒋品

安徽医药 2018年11期

胡丽，饶婷，段丹，段菲，黄焱琼，蒋品

(1.英山县人民医院麻醉科，湖北黄冈 438700；2.武汉大学人民医院泌尿外科，湖北武汉 433000)

缺血再灌注损伤(IRI)是临床上比较常见的病理生理过程，经常发生于失血性休克、肾移植、大血管手术等[1]。其机制比较复杂，可能与氧化应激、钙离子超载、炎性因子参与、细胞凋亡、一氧化氮含量变化等多因素有关。硫化氢(H2S)是近年来发现继一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)之后的第三种内源性气态信号分子，在体内以H2S/硫氢化钠(NaHS)的形式保持动态平衡[2]。GYY4137作为一种新型的H2S供体，在生理的pH和温度条件下可缓慢分解和释放H2S[3]。因此，本研究旨在研究GYY4137在肾脏IRI过程中的保护作用及机制。

1 材料与方法

1.1实验试剂及器材GYY4137为Sigma 公司产品；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)为美国贝克曼LX20型全自动生化分析仪检测；丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所生产；原位细胞凋亡检测试剂盒为德国罗氏生物技术有限公司生产； RNA提取试剂盒及反转录试剂盒为威佳科技有限公司生产。

1.2实验动物与分组研究时间为2015年6月至2016年6月。健康雄性成年Wistar大鼠45只，体质量250～300 g，购于湖北省疾病预防控制中心，所有实验均获武汉大学动物实验伦理委员会批准。所有动物饲养在饲养于武汉大学人民医院实验动物中心，自由进食、进水。大鼠按随机数字表法分为以下3组，每组15只：(1)对照组(A组)：以2%浓度戊巴比妥钠，50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，暴露左侧肾脏，仅游离左侧肾蒂，不给予任何干预措施，暴露45 min 后缝合切口;(2) 缺血再灌注(B组)：使用无损伤动脉夹闭左侧肾蒂，45 min后取下动脉夹再灌注，肉眼观察肾脏由暗红色变为鲜红色，说明肾脏再灌注成功，缝合切口关腹；(3)缺血再灌注+GYY4137组(C组)：手术方法同B组保持一致，再灌注同时腹腔注射GYY4137(100 μmol·kg-1)。

1.3取材与标本制备所有大鼠在灌注后24 h，快速脱颈椎法处死所有大鼠，快速采集左侧肾脏组织标本。一半组织固定于4%多聚甲醛用于组织学检查，另一半组织放置液氮中冷冻后转入-80 ℃冰箱保存。

1.4苏木精和伊红(HE)染色用生理盐水将左侧肾脏组织冲洗干净后，置于4%的甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，常规石蜡包埋后4 μm厚切片，经脱蜡、水化，HE染色后封片。

1.5血液Scr、BUN、SOD、MDA测定采集各组的血液标本，用生化分析仪测定各组Scr、BUN含量。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，操作按照说明书指示进行。

1.6细胞凋亡检测生精细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法，细胞核染成棕黄色者为TUNEL阳性细胞，光镜下(×200)每张切片选取10个视野。生精细胞的凋亡指数(AI)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7反转录聚合酶链反应(RT-PCR) 采用Trizol法提取肾脏组织样本总RNA，依产品说明书取RNA 1 μg反转录成cDNA。反应条件为：反转录50 ℃ 15 min，95 ℃ 40 s；循环条件为：92 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、70 ℃ 45 s，40个循环(预变性，变性，退火，延伸)。引物序列：caspase-3正义链5′-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3′，反义链5′-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3′；Bax正义链5′TGAACTGGACAACAACATGGAG3′，反义链5′AGCAAAGTAGAAAAGGGCA-ACC3′；Bcl-2正义链5′TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT3′，反义链5′CTGATTTGACCATTT GCCTG3′；GAPDH正义链5′TGCTATGTTGCCCTAGAC3′，反义链5′GTTGGCATA GAGGTCTTTACGG3′。实验测定所得Ct值即为mRNA表达水平，用2-△△Ct法得出各组样品mRNA相对表达水平。

2 结果

2.1肾脏组织的病理学改变A组未见明显的组织病理学改变，肾小管上皮细胞无变性坏死；B组可见肾小管扩张和充血，肾小管上皮细胞水肿和坏死；与B组相比，C组可见肾小管上皮细胞损伤减轻，可见部分肿胀、变性和细胞脱落。见图1。

2.2肾脏组织中Scr、BUN、MDA、SOD含量的变化B组中MDA、Scr、BUN含量较A组明显增加，GYY4137治疗后，C组的MDA、Scr、BUN含量较B组显著降低(P<0.05)，B组，C组和A组比较均差异有统计学意义(P<0.05)；与A组相比，B组SOD活性明显降低，GYY4137治疗后增加了肾脏组织中SOD的活性， C组较B组活性显著增加(P<0.05)，B组，C组和A组比较均差异有统计学意义(P<0.05)，具体数据见表1。

2.3肾小管上皮细胞凋亡情况A组可见较少的、散在的肾小管上皮细胞凋亡，凋亡指数(4.58±0.43)%；B组中凋亡细胞显著增加，染色阳性细胞以远端肾小管上皮细胞多见，凋亡指数为(23.52±1.87)%，与A组相比差异有统计学意义(P<0.05)；C组细胞凋亡较B组明显减少，凋亡指数为(10.86±0.87)%，差异有统计学意义(P<0．05)。见图2。

2.4肾脏组织中Bax、Bcl-2和caspase-3mRNA的表达水平Bax、caspase-3在B组中的mRNA表达水平，与A组比较显著增加，GYY4137治疗后，Bax、caspase-3在C组中的mRNA表达水平较B组有所降低，B组，C组和A组比较均差异有统计学意义(P<0.05)；Bcl-2在A组中mRNA表达水平明显高于B组和C组，B组，C组和A组比较均差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

3 讨论

H2S已被证实是一种有效的分子，在肾脏IRI过程中具有保护作用[4]。目前为止，在广泛的生物和药理实验中，NaHS通常作为H2S的供体，在水中溶解后短时间内释放出大量的H2S，很难达到持续稳定的治疗效果[3]；而GYY4137作为一种新型的H2S供体，其特点是缓慢释放H2S并能维持相对稳定的浓度，可更加有效的模拟体内H2S的释放过程[5]。Meng等[6]研究发现GYY4137处理后，可明显增加心脏射血分数，减少缺血面积，从而对IRI大鼠心肌产生保护作用;Tang等[7]报道了GYY4137在大鼠急性肺损伤的病理过程中发挥抗炎的作用。本实验通过组织学观察可见IRI组出现明显的病理学和形态学上的变化，经GYY4137治疗后明显改善了肾脏IR组织学损伤。

氧化应激是内源性促氧化因子及反应活性氧(ROS)的过度产生，为众多疾病致细胞功能障碍及组织损伤的病理生理机制[8-9]。IRI过程中伴有ROS的产生，而后者促进了IRI引起的损伤。正常情况下，SOD是体内重要抗氧化酶，能通过消除多余的ROS起到细胞保护作用，其抗氧化能力可改善IRI； MDA是脂质过氧化反应的稳定终产物，通常用来评价氧化应激条件下细胞的损伤程度[10]。BUN和Scr是人体内代谢的产物，是评价肾功能常用的指标。肾功能损伤后，肾小球滤过率下降，肾脏失去代偿能力，将导致后血液中BUN、Scr升高。本研究表明，GYY4137处理后可明显使IRI肾脏组织中氧化应激水平降低，从而减轻肾脏功能的损伤。

越来越多的研究表明，细胞凋亡在肾脏IRI的病理过程中有重要的作用[11]。IRI可刺激内皮细胞炎症信号级联反应，释放氧自由基，使机体ROS过度生成，最终导致细胞特异性凋亡，使机体发生损伤[12-13]。很多研究指出细胞凋亡的途径主要有内在(线粒体)和外在(死亡受体)两条信号转导通路[14-15]。在肾脏IRI过程中，诱导细胞凋亡的主要是线粒体信号转导通路。正常情况下，caspase-3一般以酶原的形式存在，是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶中重要的组成部分，同时也是最关键的下游凋亡蛋白酶的汇聚点[16]。当细胞接受凋亡刺激时，caspase-3被激活，通过信号转导引起细胞底物的降解而诱导凋亡[17-18]，其激活是通过一系列的信号转导通路之间的相互作用决定的，其中抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax起到了关键的作用[19]，其变化是细胞凋亡损伤中另一个重要的因素[20]。本实验IRI组中，凋亡水平明显高于对照组；经GYY4137治疗后，凋亡水平显著降低。以上实验结果表明GYY4137在肾脏IRI过程中发挥抗凋亡的作用。