VISTA信号阻断对DC-CIK杀伤恶性肿瘤细胞的影响

杨惠宽， 苑召虎， 陈小洁， 魏亚明， 谌丹丹

（1.广州医科大学附属市一人民医院输血科，广东 广州 510180；2.广州医科大学附属市一人民医院放射科，广东 广州 510180）

T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域（V-domain Ig suppressor of T cell activation，VISTA）是一种新发现的抑制细胞毒性T细胞活化的负调节调控点，类似于程序性死亡受体-配体1（programmed death ligand-1，PD-L1）。最新的研究结果显示，由VISAT信号活化引起的细胞毒性T细胞的负调节在肿瘤细胞免疫逃逸中发挥了重要作用[1]。VISTA抗原在髓系造血细胞和Foxp3+CD4+调节T细胞表面呈高表达，在肿瘤细胞表面不表达；抗VISTA单克隆抗体与VISTA抗原结合后可阻断VISTA信号活化引起的免疫反应负调节，增加外周血中特异性肿瘤T细胞，同时增强其在肿瘤微环境中的渗透能力及增殖、杀伤活性[2-3]。树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞（dendritic cell-cytokine-induced killer cell，DC-CIK）是一种体外诱导的、有特异性杀伤活性的免疫效应细胞，富含VISTA抗原阳性的Foxp3+CD4+调节T细胞，可通过释放细胞内的穿孔素、颗粒酶等活性物质及Fas-FasL途径有效杀伤多种血液系统肿瘤细胞、清除放化疗或骨髓移植后体内残余病灶和微小病灶、预防肿瘤复发转移[4-5]。本研究拟通过对DC-CIK表面VISTA抗原的封闭阻断来抑制VISTA信号活化引起的免疫反应负调节，以期增加DC-CIK对恶性肿瘤细胞的杀伤活性。

1 材料和方法

1.1 DC-CIK的培养及鉴定

用Ficoll分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司）分离供者单个核细胞，取外周血单个核细胞层，用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）洗涤并重悬后，置37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养75 min，贴壁细胞加入G70-7551无血清培养基（日本TAKARA公司）进行树突状细胞（dendritic cell，DC）培养；悬浮细胞加入细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cell，CIK）培养基进行CIK培养；培养至第8天，将肿瘤抗原刺激的DC与上述CIK共培养，培养至第14天，产生一种有特异性肿瘤杀伤活性的免疫效应细胞，即DC-CIK。鉴定：细胞活率＞95%；细菌、真菌、支原体、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、梅毒螺旋体（Treponema pallidum，Tp）及细菌内毒素检测全部阴性；CD3+CD56+细胞＞20%，CD3+CD4+细胞＜15%，CD3+CD8+细胞＞50%，CD86+细胞＞5%， 与文献报道[5]一致。

1.2 DC-CIK与抗VISTA抗体的结合率

培养成熟并鉴定合格后的DC-CIK 800×g离心5 min，弃上清；PBS洗涤2次后，用PBS重悬，调节细胞浓度至106个/mL。取上述细胞悬液1 mL，分别加入1、2 和4 μL兔源性抗VISTA单克隆抗体（美国Abcam公司），即体积比分别为1 000∶1、500∶1、250∶1。室温下孵育2 h，PBS洗涤2次后，加1 mL PBS重悬，然后加入2 μL Alexa Fluor 594标记的羊抗兔多克隆抗体（美国Abcam公司），室温下避光孵育1 h。PBS洗涤并重悬，3 h内采用LSRFortessa流式细胞仪（美国BD公司）检测。

1.3 抗VISTA抗体对DC-CIK杀伤活性的影响

用含10%胎牛血清（美国Invitrogen公司）的培养基将效应细胞（DC-CIK）浓度调整至1×106个/mL，靶细胞[人慢性髓系白血病细胞株K562（南京凯基生物技术有限公司）]浓度调整至50 000和100 000个/mL，分别取100 μL加入相应96孔板中，即效靶比例为20∶1、10∶1，边缘孔用无菌PBS填充。37 ℃、5% CO2培养24 h后每孔加入20 μL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT] （美国Sigma公司）溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT，用无菌PBS配置），继续培养4 h后终止培养，弃去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜（美国Sigma公司），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。采用SpectraMax iD5多功能微孔读板机（美国Molecular Devices公司）测定490 nm处各孔的吸光度（A）值。杀伤活性（%）=[（靶细胞孔A值+效应细胞孔A值-实验细胞孔A值）/靶细胞孔A值]×100%。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 DC-CIK与抗VISTA抗体的结合率

当DC-CIK与抗VISTA抗体的体积比分别为1 000∶1、500∶1、250∶1时，VISTA阳性的DCCIK比例分别为（9.96±0.54）%、（9.98±0.37）%和（10.26±0.57）%，三者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。即使进一步增加抗VISTA抗体的浓度也无法增加二者的结合率。见图1。

图1 DC-CIK与抗VISTA抗体不同体积比时DC-CIK表面VISTA抗原的表达情况

2.2 VISTA信号阻断后DC-CIK杀伤活性的变化

将未经处理的DC-CIK作为对照组，将用抗VISTA抗体处理的DC-CIK作为实验组。对K562细胞的杀伤活性结果显示，当效应细胞∶靶细胞为10∶1和20∶1时，实验组DC-CIK的杀伤活性分别为（77.3±6.8）%和（92.8±5.9）%，均明显高于对照组[（68.4±4.0）%、（81.8±5.4）%]（P＜0.01）。

2.3 VISTA信号阻断后DC-CIK增殖的变化

孵育处理54 h后，对照组的细胞数由1.00×106个/mL增加至（2.32±0.31）×106个/mL，实验组的细胞数由1.00×106个/mL增加至（3.14±0.48）×106个/mL。实验组细胞数明显高于对照组（P＜0.01），为对照组的1.35倍。见图2。

图2 抗VISTA抗体对DC-CIK增殖的影响

2.4 阻断VISTA信号对DC-CIK分化的影响

实验组DC-CIK中CD3+CD56+自然杀伤性T（natural killer T，NKT）细胞（DC-CIK中的主要效应细胞）百分比为（35.12±2.13）%，明显高于对照组[（21.35±1.32）%]（P＜0.01）。见图3。

图3 VISTA抗体处理对DC-CIK分化的影响

3 讨论

细胞免疫治疗是除手术、放疗及化疗外一种新发展的治疗技术，被美国《Science》杂志评为2013年排名第一的重大科学发现。然而，肿瘤细胞的免疫逃逸使得多种恶性肿瘤细胞能够逃避免疫效应细胞的识别和攻击，得以在体内继续生存和增殖，成为细胞免疫治疗面临的主要挑战[6-7]。最新的研究结果显示，VISTA信号的阻断可通过降低肿瘤微环境中髓系来源的单个核细胞和增加活化的树突状细胞来改变肿瘤微环境的抑制性特征；此外，VISTA信号的阻断还可减少Foxp3+CD4+调节T细胞在肿瘤微环境中的存在，抑制Foxp3+CD4+调节T细胞的免疫抑制活性[1，8]。动物实验结果表明，抗VISTA抗体可促进免疫效应细胞的增殖、活化及一系列细胞因子[干扰素-γ（interferon gamma，INF-γ）、白细胞介素-2（interleukin 2，IL-2）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等]的分泌，解除T细胞对肿瘤细胞攻击的束缚，显著提升免疫系统的肿瘤杀伤活性，可使肿瘤大幅萎缩[8-9]。

DC-CIK是一个新型的免疫活性细胞群体，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（抗CD3抗体、IL-2、IFN-γ等）诱导扩增一段时间后获得的一群异质性细胞，其中 CD3+CD56+NKT细胞和CD3+CD8+细胞毒性T细胞在对肿瘤细胞的杀伤中发挥着至关重要的作用。采用DC-CIK进行细胞免疫治疗可迅速缓解白血病患者的临床症状，大大延长晚期白血病患者的带瘤生存时间并改善其生存质量（如增加食欲、改善睡眠、增强体质等）[9]。虽然DC-CIK免疫治疗可有效杀伤多种血液系统肿瘤细胞，然而肿瘤细胞的免疫逃逸及机体免疫反应的负调节严重限制了DC-CIK临床疗效的发挥[5，10]。因此，一种既有特异性肿瘤杀伤活性，又能抑制肿瘤细胞免疫逃逸的特异性免疫效应细胞将更有利于杀伤和清除体内肿瘤细胞，抑制其免疫逃逸。本研究结果显示，抗VISTA抗体可特异性地结合于DC-CIK表面，因抗原抗体的结合具有一定的特异性，因此抗体的结合情况亦反映了DC-CIK表面VISTA抗原的表达情况。肿瘤细胞可通过VISTA信号活化引起的DC-CIK免疫反应的负调节发生免疫逃逸。抗VISTA抗体与其抗原结合后可阻断由VISTA信号活化引起的免疫反应负调节，增加外周血中特异性肿瘤T细胞的数量，并增强其在肿瘤微环境中的渗透能力、增殖能力及杀伤活性[2]。本研究结果显示，抗VISTA抗体诱导可显著促进DC-CIK的增殖；此外，抗VISTA抗体体外诱导还可以提高DC-CIK中有效杀伤细胞（CD3+CD56+NKT细胞）的比例。

与传统的放疗和化疗药物的作用机制不同，抗VISTA抗体不是通过直接杀伤肿瘤细胞发挥作用，而是间接通过增强免疫效应细胞的杀伤活性来发挥抗肿瘤作用[8]。 然而，对于免疫缺陷或自身免疫力低下的患者，新型抗肿瘤免疫制剂药效的发挥将大大受限，而且大部分肿瘤患者由于长期进行放化疗，严重损伤了自身免疫系统，限制了抗肿瘤免疫制剂药效的发挥。经抗VISTA抗体处理的DC-CIK可通过在体外扩大培养，使其细胞数目增至体内细胞数目的数百倍以上，不仅可以显著增加患者特异性抗肿瘤杀伤细胞的数量，弥补其自身免疫力低下的缺陷，而且还可以抑制由VISTA信号活化引起的肿瘤细胞的免疫逃逸。

总之，本研究揭示了抗VISTA抗体增强DCCIK杀伤肿瘤细胞的内在机制，以期能提高细胞免疫治疗技术对顽固性血液系统疾病的疗效和临床应用价值。