慢性HE患者肠道细菌种类与血清炎性因子相关性分析

刘冀川

（四川省肿瘤医院检验科，四川 成都 610041）

肝脏拥有包括肝动脉与肝门静脉的丰富血液供应，且与肠道联系紧密，肝门静脉接收的血液主要是来自肠道中静脉血液的汇入，而形成了一种肝-肠循环轴[1]。近年来对肝-肠循环轴的研究发现，肠道微生态的变化与慢性肝功能损伤有着密不可分的关系[2]。肝硬化是一种临床上常见的慢性肝病，呈进行性发展，发展至终末期时可出现多种不同程度的并发症，包括肝性脑病（hepatic encephalopathy，HE）[3]。HE是肝硬化最严重的一种并发症，但目前尚不清楚肠道微生态在慢性HE发病中的确切机制。肝硬化发展至一定程度时出现的肠道微生态失衡或移位可促进机体炎性反应的产生[4]，然而目前尚不清楚慢性肝硬化失代偿期HE与血清炎性因子变化及肠道微生态的关系。因此，本研究探讨了慢性肝硬化并发HE患者肠道常见细菌与血清炎性因子[肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23]变化的相关性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

从2015年8月—2017年2月在四川省肿瘤医院住院的慢性乙型肝炎肝硬化肝功能失代偿期的患者中筛选出并发HE的患者120例（HE组），其中临床分期Ⅰ期36例、Ⅱ期50例、Ⅲ期31例、Ⅳ期3例。另选取未并发HE的慢性乙型肝炎肝硬化患者100例（对照组）。记录所有患者的年龄、性别、肝功能指标[血清白蛋白（albumin，Alb）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（total bilirubin，TB）和凝血酶原时间（prothrombin time，PT）]变化及肝功能Child分级情况，同时测量所有患者粪便（成形）湿重。所有患者均知情同意。

1.2 纳入标准和排除标准

1.2.1 纳入标准 （1）符合乙型肝炎后肝硬化的诊断标准[5]：有乙型肝炎病史、存在慢性肝炎肝硬化失代偿期的临床症状和体征、乙型肝炎表面抗原标志物血清学检测阳性超过半年、已出现肝功能异常，腹部B超和计算机断层扫描等影像学检查明确诊断为肝硬化失代偿期；（2）HE的诊断是在肝硬化失代偿期诊断的基础上出现了以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调的症状，表现为不同程度的意识障碍、空间定向力减弱、行为异常和神志昏迷；（3）入组前2周内未进行任何抗病毒药物及保肝治疗、未服用微生物制剂及抗菌药物。

1.2.2 排除标准 （1）心、肺、肾功能严重不全；（2）由其他原因引起的肝损伤；（3）其他部位有感染征象；（4）糖尿病以及上消化道大出血；（5）使用糖皮质激素及抗精神病类药物；（6）长期酗酒并患有各类精神、神经疾病；（7）存在胃肠道创伤或有外科手术史。

1.3 指标检测

1.3.1 肠道微生态变化 采用荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测所有患者肠道中12种常见细菌的分布情况。收集患者晨起经隐血实验证实为阴性且未受尿液污染的尾便，置无菌样本收集器中，搅匀后称重，取200 mg分装于无菌Eppendorf管，-80 ℃保存备用。统一进行粪便总DNA提取和PCR。各类细菌的引物序列参照GenBank（https：//en.wikipedia.org/wiki/Gene_bank）进行合成，本研究设计的细菌引物序列见表1。PCR后再进行荧光定量PCR检测，最后将定量检测到的粪便DNA拷贝数转换为对数值并进行分析。采用细菌16S rRNA作为内参基因。

1.3.2 血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10检测 采用无菌管采集所有患者清晨空腹全血5 mL，静置30 min，278×g离心5 min，取上清，分装于无菌Eppendorf管中进行血清炎性因子的检测或置于-80 ℃冰箱中保存备用。血清TNF-α、IL-12、IL-6和IL-10采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测，试剂盒购自武汉碧云天有限公司，检测步骤严格按照操作说明书进行。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验。计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验。计量指标之间的相关性分析采用Pearson直线相关分析；肝功能Child分级与菌落或血清炎性标志物之间的相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 细菌引物序列

2 结果

2.1 HE组与对照组基本情况及肝功能指标比较

HE组与对照组之间一般指标、粪便湿重及PT差异均无统计学意义（P＞0.05），但血清Alb、ALT、AST、TB以及肝功能Child分级差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 HE组与对照组肠道细菌种类比较

与对照组比较，HE组显著增殖的肠道细菌有肠致病性大肠埃希菌、假单胞菌属、肠球菌属、普雷沃登菌属、葡萄球菌属、梭菌属和白念珠菌（P＜0.05）。显著减少的细菌有双歧杆菌、链球菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌和瘤胃球菌属。除链球菌属和拟杆菌属外，其他细菌差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.3 HE组与对照组血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比较

HE组血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平均明显高于对照组（P＜0.001）。见表4。

2.4 HE组与对照组肠道细菌与肝功能指标的相关性分析

HE组肠道中致病性大肠埃希菌与Alb呈负相关，与ALT、AST及肝功能Child分级呈正相关，链球菌属与TB及PT呈正相关，假单胞菌属与Alb、TB及肝功能Child分级呈正相关，普雷沃登菌属与ALT呈负相关，乳酸杆菌与Alb、ALT及AST呈正相关，瘤胃球菌属与Alb、ALT及肝功能Child分级呈负相关，梭菌属与ALT及TB呈负相关。对照组中只有致病性大肠埃希菌与肝功能指标相关。见表5、表6。

2.5 HE组与对照组肠道细菌与血清炎性因子的相关性分析

HE组致病性大肠埃希菌与IL-12、IL-10和IL-23呈正相关；双歧杆菌与TNF-α和IL-23呈负相关，与IL-12和IL-1β呈正相关；链球菌属与IL-10呈正相关；肠球菌属与TNF-α、IL-10呈正相关，与IL-12呈负相关；拟杆菌属与TNF-α、IL-10及IL-23呈正相关；普雷沃登菌属与TNF-α、IL-6、IL-1β及IL-23均呈正相关；乳酸杆菌与IL-6和IL-10呈负相关；瘤胃球菌属与IL-12、IL-1β及IL-23呈负相关；梭菌属与IL-12、IL-10呈正相关，与IL-6呈负相关。对照组中只有致病性大肠埃希菌与6种炎性因子相关。见表7、表8。

表2 HE组与对照组基本情况及肝功能指标的比较

表3 HE组与对照组肠道常见细菌比较

表3 HE组与对照组肠道常见细菌比较

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表4 HE组与对照组血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比较 （pg/mL，

表4 HE组与对照组血清TNF-α、IL-12、IL-6、IL-10、IL-1β和IL-23水平的比较 （pg/mL，

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表5 HE组肠道细菌与肝功能指标的相关性

表6 对照组肠道细菌与肝功能指标的相关性分析

表7 HE组肠道细菌与血清炎性因子的相关性

3 讨论

人体肠道正常微生态的主要成分是专性厌氧菌，包括双歧杆菌、球菌和乳酸杆菌，而其他的兼性需氧菌是指一类无致病性的大肠埃希菌、链球菌和肠球菌，尽管这类细菌在正常情况下对人体无害，但是当肠道环境改变时会转变为致病菌。2011年，ARUMUGAM等[6]检测了人体正常肠道中的厌氧菌宏基因组序列，结果显示这些非随机组合的肠道细菌可以大致分为拟杆菌属、普雷沃登菌属和瘤胃球菌属，并且这些菌属均与人的年龄、性别、人种、体重指数以及区域环境无关[6]。有研究结果显示，在慢性乙型肝炎和由其所致的肝硬化患者中，存在着不同程度的肠道微生态失衡现象，而且菌属的多样性也较差[7]。

肝硬化发展至一定程度时，肠道微生态受到破坏，使肠道防御能力下降而导致微生态失衡或细菌移位，引发机体出现免疫炎性反应，释放的一系列炎性细胞因子（TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-10等）产生级联反应[8-9]，损伤机体重要脏器，其中就包括肝脏。本研究结果显示，HE组肝功能异常程度明显高于对照组（P＜0.05），而且上述6种炎性因子水平也要明显高于对照组（P＜0.05），表明肝功能异常程度可能与免疫炎性因子的异常表达有关。此外，因为肝功能指标是对肝脏功能受损程度最直接的反映，且大多数HE患者肠道细菌与不同肝功能指标存在不同程度的相关性，这意味着肠道微生态的失衡可能与HE的发生及病情进展相关。然而肠道细菌的种类与慢性肝病发生、发展的关系如何以及二者的相关作用机制目前尚不明确。本研究中结果显示，HE患者肠道中的不同细菌出现显著增殖或显著减少，说明肝硬化并发HE的患者肠道微生态严重失衡，这与文献报道[10-11]一致。肠道微生态有调节免疫炎性因子产生和释放的作用。陈萌萌[12]的研究结果显示，慢性乙型肝炎及其所致肝硬化患者除肠道微生态失衡外，肠道细菌种类还与多种炎性因子存在相关性。本研究结果显示，大多数HE患者肠道细菌与TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β、IL-23、IL-10相关，而且相关的细菌种类和程度均高于对照组，表明HE患者肠道中异常增殖的细菌产生了更多、范围更广的炎性反应，激活了机体免疫炎性细胞。这些活化的免疫细胞产生了大量的细胞因子和炎性因子，从而加重了肝脏的炎性反应和组织损伤[13-14]，进一步使得肝功能减退，加重了HE病情。

综上所述，肠道微生态失衡可能参与慢性乙型肝炎肝硬化并发HE发生、发展及肝功能损伤过程，并且多种免疫炎性因子产生和分泌的协同调控可能也与HE发展的病理机制相关。