抗结核分枝杆菌多表位融合抗原IgG抗体检测最佳临界值的建立和初步应用

戚应杰，石玉如，刘 婷，岳 莉，赵长城，王 云，马筱玲

（1. 安徽省立医院感染病院检验科，安徽 合肥 230022；2. 安徽省立医院，安徽 合肥 230022）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一种传染病，最常见的患病部位是肺部。2012年，全球约有860万例结核新发病例，约130万人死于结核病[1]，结核病已成为影响全球的重大公共卫生问题。可靠、准确的检测方法是结核病诊断和治疗的关键。目前，MTB培养或影像学检查仍是诊断结核病的金标准。MTB特异性分泌蛋白的抗体检测对结核病的诊断具有重要的意义。利用基因工程技术将MTB的特异性分泌蛋白制成融合蛋白，采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清中的特异性抗体对于结核病的诊断有重要的临床意义[2]。但有研究结果显示，ELISA的结果易受实验中多种因素和Cut-off值设定的影响，普遍存在准确性和重复性不高的缺点[3-5]。本研究拟建立抗结核分枝杆菌多表位融合抗原IgG抗体（anti-multi-epitope fusion antigen IgG antibody of Mycobacterium tuberculosis，MTB-Ab）检测的最佳临界值，并评价其在肺结核诊断中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年5月—2016年12月安徽省立医院感染病院结核科门诊及住院的肺结核患者120例，其中活动性肺结核62例、非活动肺结核58例，诊断标准均符合2001年中华医学会结核病学分会制定的肺结核诊断标准。以同期安徽省立医院感染病院168名体检健康者作为正常对照组。各组间性别、年龄差异均无统计学意义（P＜0.05）。所有患者甲、乙型肝炎病毒感染指标均为阴性，未合并其他急性感染性疾病。

1.2 方法

采集所有对象清晨空腹肘静脉血4 mL，2 000×g离心10 min，分离血清，-80 ℃保存待测。检测仪器为STAT FAX2100酶标仪（美国Awareness公司），MTB-Ab ELISA检测试剂盒购自上海荣盛公司，严格按标准操作程序进行操作。试剂盒说明书建议的Cut-off值为阴性对照平均吸光度（A）值+0.12，取0.18。将样本孔A值/Cut-off值定义为Cut-off值指数（cut-off index，COI）。室内质控在控后进行检测。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。呈非正态分布的数据以中位数（M）[四分位数（P25～P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。分别以正常对照组和非活动性肺结核组为对照绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，使用Medcalc 15.10软件确定最佳Cut-off值，计算最佳COI值，以此作为自建临界值计算敏感性、特异性、约登指数、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值和阴性预测值，并与以试剂盒Cut-off值为临界值得出的诊断性能进行比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTB-Ab诊断肺结核的最佳COI值

以正常对照组为对照，MTB-Ab诊断肺结核的曲线下面积（area under curve，AUC）[95%可信区间（confidence interval，CI）]为0.891（0.852～0.930），最佳COI值（COI1）为0.90，此时敏感性为92.50%，特异性为82.10%；以非活动性肺结核组为对照，MTBAb诊断活动性肺结核的AUC（95%CI）为0.721（0.632～0.799），最佳COI值（COI2）为3.65，此时敏感性为79.03%，特异性为62.07%。

图1 MTB-Ab诊断肺结核的ROC曲线

2.2 肺结核组与正常对照组COI值比较

肺结核组COI值为4.57（1.15～6.85），明显高于正常对照组[1.25（0.31～2.90）]（P＜0.05）。活动性肺结核组COI值为6.52（4.27～11.98），明显高于非活动性肺结核组[3.12（2.35～5.02）]（P＜0.05）。见图2。

图2 正常对照组与肺结核组之间COI值的比较

2.3 不同临界值的诊断性能比较

分别以试剂盒Cut-off值（0.18）、COI1（0.90）及COI2（3.65）作为诊断肺结核的临界值，进行诊断性能评价。结果显示，COI1的敏感性高于试剂盒Cut-off的敏感性（P＜0.05），特异性、约登指数、阳性似然比、阴性似然比、阳性预测值、阴性预测值二者之间差异均无统计学意义（P＞0.05）；COI2的敏感性、特异性、约登指数、阳性似然比、阳性预测值、阴性预测值均显著低于COI1（P＜0.05），而阴性似然比显著高于COI1（P＜0.05）。见表1。

表1 不同临界值下MTB-Ab诊断肺结核的性能评价

3 讨论

虽然结核病的防控取得了一定的成效，但目前全球每年仍有大约150万人死于结核病[6]。结核病防治面临的挑战是多方面的，包括获得性免疫缺陷综合征与结核病的双重感染、缺乏有效的疫苗、不断出现的耐多药MTB[7]等，其中最重要的一点是没有特异性的生物标志物，无法对结核病作出早期诊断[8-9]。结核病患者外周血MTB抗体的检测具有简便、快捷的特点，但因其抗原的特异性不高、干扰因素多和受Cut-off值设定等的影响，造成其诊断准确性不高[5]，不能作为单独的诊断标准。目前的诊断试剂并不能满足临床需要，导致血清学诊断在结核病中的诊断价值一直存在争议。

本研究采用的商品化试剂盒的成分为利用基因工程技术克隆表达的致病性MTB的7种结核特异性表位抗原，通过将7种特异性抗原（38 000、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3）优势肽段分别制备成融合抗原来提高抗原的特异性[10-12]。利用多表位MTB特异性融合抗原检测MTB抗体成为近年来不少学者研究的热点。血清学诊断在结核病中的诊断价值有望被重新挖掘。周鹏等[13]联合MTB 7种特异性抗原检测患者血清中的抗体，结果显示多种抗原联合检测可提高MTB抗体检测的敏感性，7种抗原在血清抗体检测中具有抗原互补性，不同抗原与机体反应存在不同的反应模式。本研究同时使用全自动酶标仪、标准操作程序和最佳COI值来消除传统方法检测MTB抗体的影响[14]，并评价MTB-Ab诊断肺结核的价值。

本研究结果显示，正常对照组与肺结核组之间、活动性肺结核与非活动性结核组之间COI值差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC曲线分析显示，MTB-Ab诊断肺结核的AUC（95%CI）为0.891（0.852～0.930），说明用MTB-Ab诊断MTB感染具有较高的准确性；以正常对照组为对照得出的最佳COI值（COI1）为0.90，此时敏感性为92.50%，特异性为82.10%。本研究进一步对2个临界值的诊断性能进行了评价，结果显示COI1的敏感性高于试剂盒Cut-off值（P＜0.05），说明通过ROC曲线确定最佳COI值比试剂盒Cutoあ值在结核病的诊断上更有价值。

本研究结果还显示，以非活动性肺结核组为对照得出的最佳COI值（COI2）作为临界值时，其主要性能指标（敏感性、特异性、约登指数、阳性似然比、阳性预测值、阴性预测值）与COI1比较均明显降低，阴性似然比则明显升高，说明对活动性肺结核的诊断性能反而下降了。由此可见，MTB-Ab检测在鉴别诊断活动性肺结核与非活动性肺结核中不理想，还有待进一步改进。

综上所述，MTB-Ab具有较高的临床诊断价值，以最佳COI值作为临界值可获得最大诊断效能，可以为结核病的诊断提供依据。