魏氏核归丸对腰椎间盘突出大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1表达的影响

沈连丽，莫如荣，张建华，张志杰，马欣，魏道德

1.湖州市南浔区菱湖人民医院药剂科，浙江 湖州 313018

2.驻马店魏道德骨科医院风湿免疫科，河南 驻马店 463000

腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation，LDH)是临床骨科的常见病，主要是在腰椎间盘退变的基础上，外力因素导致纤维环破裂，髓核组织从破裂处突出甚至脱出，压迫邻近脊神经根，产生腰腿疼痛、麻木等症状[1～3]。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)及其抑制剂(Tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)在维持椎间盘细胞外基质成分的动态平衡中发挥重要作用，MMP是主要的基质蛋白降解酶，其酶活性增强将造成基质过度降解，导致椎间盘退变，而内源性TIMP可直接抑制MMP活性[4]。研究发现退变椎间盘中MMP含量升高，TIMP却相对不足，这就造成椎间盘内蛋白减少、基质成分改变[5～6]。魏氏核归丸是驻马店魏道德骨科医院长期临床实践总结的经验方，此方主治腰椎间盘突出症，能消除腰椎炎症，减轻水肿，使神经压迫症状得以缓解，进而起到行气活血、祛风除湿、消炎止痛等功效，但其具体作用机理尚未阐明。故本研究通过建立LDH大鼠模型，探究魏氏核归丸对LDH大鼠病变椎间盘组织MMP2、MMP9、TIMP1表达的影响，以期为临床治疗LDH提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组 SPF级SD健康大鼠60只，体质量180～220 g，雌雄不限，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物批号：SYXK(京)2017-0022。将大鼠随机分为5组，每组12只，包括假手术组、模型组以及魏氏核归丸低、中、高剂量组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)。

1.2 药物 魏氏核归丸来自驻马店魏道德骨科医院，由杜仲、炒菟丝子、酒当归、狗脊各600 g，续断、宣木瓜、独活各300 g，土元、醋乳香、醋没药各250 g，香附、木香各150 g、骨碎补450 g、醋延胡索500 g、熟地黄900 g和制马钱子82 g，共16味中药组成。功效：补肾壮骨、滋肝养筋、行气活血、祛风除湿、扶正祛邪；用法：1次9 g，1天3次，饭后服用。根据人鼠体表面积等效量法换算出200 g大鼠用药剂量为1次162 mg，以此作为中剂量，设低、中、高剂量比例为1∶2∶4，即低剂量为81 mg，高剂量为324 mg。临用时将药丸用生理盐水配成81、162、324 mg/mL的混悬液。

1.3 动物模型制备 10%水合氯醛按照0.5 mL/100 g腹腔麻醉，麻醉起效后右侧卧位固定于手术台，背毛消毒，正中切开鼠尾暴露椎间盘，连续勾出6个椎间盘，浸入无菌生理盐水中，迅速缝合伤口。将1个椎间盘用生理盐水稀释后，搅拌成混悬液备用。于正中切开大鼠背部，暴露L4～L5横突、刺突，显微镜下切开L5左侧椎板，在神经根和硬脊膜间置入自体尾椎椎间盘，同时将尾椎椎间盘稀释液注入硬膜囊外与神经根周缘，注意髓核接触但未压迫神经根。甲硝唑冲洗后逐层缝合伤口。假手术组仅暴露神经根后缝合伤口，其他操作同上。

1.4 给药处理 造模后5天，每天注射青霉素8万U/只预防感染，正常喂养，至大鼠尾部结痂。造模5天后连续灌胃给药14天，1天3次，每次低剂量组给予1 mL/200 g低浓度药液(81 mg/mL)；每次中剂量组给予1 mL/200 g中浓度药液(162 mg/mL)；每次高剂量组给予1 mL/200 g高浓度药液(324 mg/mL)；假手术组和模型组给予等量生理盐水。每天8∶00、13∶30、19∶00各给药1次。

1.5 行为学观察 观察大鼠有无烦躁不安(如撕咬肢体、不停舔后爪、后足或肢忽而自行抬起)，饮食变化情况，运动功能是否异常，大小便是否失禁等。

1.6 后肢痛觉实验 参照陆志东等[7]方法自制大鼠机械刺激缩爪阈值仪，由血压计、5 mL注射器内芯和磨秃的20 mL注射器针尖组装而成。造模前1天、造模后5天、灌胃后7天和14天进行测量。测量时将大鼠放入塑料杯内，露出左后肢，大鼠平静后将自制测量仪针头置于左后爪4、5趾骨间，接着向血压计充气，大鼠出现尖叫或缩爪时停止，记录血压计读数，以此作为缩爪阈值，间隔20 min测1次，取3次测量值的平均数。假设造模前1天的缩爪域值为基础域值，若高于此值则痛觉迟钝，若低于此值则痛觉过敏。

1.7 苏木精-伊红（HE）染色 末次给药结束后，各组随机选取大鼠4只，收集腰部髓核，于4%多聚甲醛溶液中固定24～48 h；脱水后石蜡包埋；用组织切片机以10μm厚度切片，60℃恒温箱中烤片3～5 h；切片用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；苏木精液染色5 min；水冲洗后75%盐酸乙醇分化30 s；水冲洗、乙醇处理后酸化伊红溶液染色2 min；乙醇脱水、二甲苯透明；用中性树胶封片、烘烤过夜。在光镜下观察并拍照。

1.8 酶联免疫（ELISA） 检测 用ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定各组大鼠腰部髓核中MMP2、MMP9、TIMP1含量。将髓核剪成碎片，加入适量标本稀释液，漩涡匀浆。向反应板各孔加入100μL样品，混匀后置于37℃恒温箱中2 h；反应板洗涤并吸干后，加入100μL一抗工作液，混匀后置于37℃恒温箱中1 h；反应板洗涤并吸干后，加入100μL酶标抗体工作液，置于37℃恒温箱中0.5 h；反应板洗涤并吸干后，加入100μL终止液并混匀；0.5 h内用酶标仪测定450 nm处吸光度。

1.9 统计学方法 用SPSS20.0统计软件进行数据处理，计量资料用(±s)表示，方差分析；计数资料用“率”描述，用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模后大鼠行为观察 各组大鼠都没出现感染、死亡情况。造模后大鼠饮食正常，左后肢出现轻度跛行、避免负重，无撕咬，没有大小便失禁情况，易激怒，魏氏核归丸干预后情况明显好转。

2.2 各组大鼠左后肢机械刺激缩爪疼痛阈值结果比较 见图1。术后5 d，与假手术组比较，模型组大鼠左后肢缩爪阈值均显著降低(P＜0.05)。灌胃7天，与模型组比较，高、中剂量组大鼠左后肢缩爪阈值均显著升高(P＜0.05)，低剂量组的差异无统计学意义(P＞0.05)，高剂量组阈值上升最快，但高剂量组与中剂量组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。与灌胃7天比较，高剂量组大鼠灌胃14天时阈值显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，且阈值趋近于假手术组(P＞0.05)。

图1 各组大鼠左后肢机械刺激缩爪疼痛阈值

2.3 各组大鼠髓核组织HE染色结果比较 见图2。假手术组椎间盘组织形态结构完整，多层纤维环排列整齐，髓核形态正常。模型组纤维环大面积坏死，且髓核数量明显减少、结构基本消失，周围出现大量透明骨质增生，正常椎间盘结构消失。低剂量组纤维环坏死明显减少，髓核数量有所增加，椎间盘、髓核组织形态有所恢复，透明骨质增生有所降低。中剂量组显示椎间盘形态基本恢复正常，异常透明骨质基本消失，髓核形态增加，纤维环形态数量恢复正常，排列整齐。高剂量组显示椎间盘形态正常，纤维环数量恢复正常且排列有序，髓核形态正常。

图2 各组大鼠髓核组织HE染色结果 (×100)

2.4 各组大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表达变化结果比较见表1。灌胃7天和14天，与假手术组比较，模型组大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠MMP2、MMP9蛋白表达水平均显著降低(P＜0.05)，且随着剂量的升高MMP2、MMP9蛋白表达水平越低，但仍高于假手术组(P＜0.05)；与灌胃7天比较，低、中、高剂量组在灌胃14天时MMP2、MMP9蛋白的表达水平均有所降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表1 灌胃后各组大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表达变化结果

2.5 各组大鼠髓核TIMP1蛋白表达变化结果比较 见表2。灌胃7天和14天，与假手术组比较，模型组大鼠髓核TIMP1蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，低、中、高剂量组大鼠TIMP1蛋白表达水平均显著升高(P＜0.05)，且随着剂量的升高TIMP1蛋白表达水平越高；与灌胃后7天比较，低、中、高剂量组大鼠TIMP1蛋白在灌胃14天时的表达水平有所降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠髓核TIMP1蛋白表达变化结果

3 讨论

LDH在中医学中属于腰痛、腰腿痛等范畴，基于肝肾脾不足，尤其是肾虚，由外伤或气滞寒凝等引起[8～9]。中医内治LDH药物以补肝益肾、活血化瘀为主[10]。魏氏核归丸是在传统核归丸的基础上，结合LDH的病因、症状，加入强腰膝、祛风湿、固肾气的狗脊，祛风湿、止痛的独活，活血、利气、止痛的醋延胡索等，为驻马店魏道德骨科医院长期临床实践总结而得，主治腰椎间盘突出、椎管狭窄、腰肌劳损、颈椎间盘突出，在临床上应用多年，取得良好疗效。现代药理研究发现活血祛瘀药物可减小血液黏稠度、扩张血管，进而改善血液循环，补肾药物可调节机体代谢、提高机体免疫力[11～12]。魏氏核归丸具有补肾壮骨、滋肝养筋、行气活血、祛风除湿、扶正祛邪的功效。本研究通过动物实验探究魏氏核归丸治疗LDH的内在分子机制，为中药的现代化研究提供参考。

本研究采用自体椎间盘移植方法制备LDH大鼠模型，所有大鼠都未感染、死亡。造模后大鼠左后肢跛行、易激怒。HE染色结果说明魏氏核归丸治疗可明显改善LDH大鼠的生物学行为及其髓核病理特征，且可缓解大鼠痛觉过敏情况。这些结果与魏氏核归丸及其他核归丸的临床治疗效果一致[13～15]。

腰椎间盘退变是LDH发生的重要内因，常表现为椎间盘基质成分改变，椎间盘细胞外基质成分一般处于动态平衡之中，椎间盘退变象征该平衡遭受破坏，MMP及其抑制剂TIMP在其中发挥关键作用[16]。细胞外基质指位于结缔组织细胞外围、内皮与上皮细胞下层，为组织、器官以及生物体提供韧性与强度的物质。胶原蛋白、蛋白多糖是椎间盘细胞外基质的主要成分，胞间框架结构主要有胶原构成，而蛋白多糖可与水结合起着对抗外压、分散负荷的作用。椎间盘由中央髓核和外周纤维环构成，髓核胶原无Ⅰ型多为Ⅱ型，而纤维环从外向里Ⅰ型胶原不断减少，Ⅱ型胶原、聚合蛋白多糖逐渐增多[17]。基质降解酶系有脯肽酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、糖苷酶和基质金属蛋白酶(MMP)6大类，其中MMP分布于多类细胞中，可广泛降解多种基质，在维持基质动态平衡中发挥最重要的作用，与癌细胞扩散、腹膜炎、关节炎、烧伤、椎间盘退变等病症及正常组织的吸收、更新密切相关[18～19]。研究发现椎间盘退变时髓核中Ⅱ型胶原被Ⅰ型取代，且有Ⅲ型胶原出现，而聚合蛋白多糖含量下降，硫酸软骨素与硫酸角质素比值下降等生物学变化[6]。椎间盘退变的直接原因是椎间盘中含有过量的MMP，MMP/TIMP失衡，椎间盘细胞活性不足，不能维持、修复胞外基质成分。腰部重负荷、强扭转、驾驶振动等机械因素是引起腰椎间盘突出的常见诱因。研究显示，腰部负荷异常改变可导致MMP/TIMP失衡，造成椎间盘基质过度降解[20]。本研究结果显示，灌胃后7天和14天，模型组、魏氏核归丸组大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1蛋白表达水平较假手术组均显著较高，MMP2、MMP9增加量高，而TIMP1增加量相对较少，说明LDH大鼠髓核MMP2、MMP9、TIMP1含量增多，MMP/TIMP失衡。魏氏核归丸干预后MMP2、MMP9表达水平均显著低于模型组，TIMP1表达水平均显著高于模型组，且随着魏氏核归丸剂量的升高，MMP2、MMP9表达水平越来越低，TIMP1表达水平越来越高，说明魏氏核归丸可缓解MMP/TIMP失衡情况，避免胞外基质过度降解。由此说明魏氏核归丸可能通过抑制大鼠髓核MMP2、MMP9蛋白表达，促进TIMP1表达，来减轻LDH大鼠的病情。

综上，本研究通过自体椎间盘移植方法成功制备LDH大鼠模型，模型组大鼠腰部髓核中MMP2、MMP9、TIMP1蛋白表达水平显著增加，魏氏核归丸治疗后LDH大鼠髓核炎症明显减轻，且髓核组织中MMP2、MMP9表达水平显著降低，TIMP1显著升高，说明魏氏核归丸可抑制髓核MMP2、MMP9蛋白表达，促进TIMP1表达，缓解LDH大鼠病情。然而LDH发生发展的相关因素很多、相关机制复杂，魏氏核归丸治疗LDH的具体作用机理还需继续深入探究。