日本血吸虫感染鼠肝脏肉芽肿细胞分离条件的优化及分离效果的流式检测

任丹丹，夏媛媛，王秀男，刘 彪，李 强，沈际佳，张玉侠

在我国血吸虫病仍是一个重大公共卫生问题，严重影响社会经济发展[1-2]。其主要危害是肝脏的虫卵性肉芽肿炎症和随后的纤维化[3]。肝脏肉芽肿细胞的分离、纯化和检测对研究虫卵肉芽肿的细胞学及免疫学机制至关重要。

有相关文献中报道采用Ⅳ型胶原酶结合注射器机械吹打分离肉芽肿细胞，但并未提供详细的实验步骤，而且尚无针对感染不通过阶段(急、慢性期)分离肉芽肿细胞的优化方案[4-7]。本研究结合国内外相关文献报道，采用Ⅳ型胶原酶两步消化法处理急、慢性血吸虫感染小鼠肝脏，通过流式检测肉芽肿细胞的主要成分以确定分离效果以获得大量的及保存细胞表面标志物的肉芽肿细胞为标准。对胶原酶浓度及消化时间进行调整，建立了分离急慢性肉芽肿细胞的有效方法。

1 材料与方法

1.1日本血吸虫感染模型的建立 C57BL/6，6-8周龄的SPF级雄性小鼠购自南京模式动物研究所。日本血吸虫阳性钉螺购自湖南省寄生虫病防治研究所，以常规方法逸出尾蚴。C57/BL6小鼠腹部去毛，盖玻片蘸取尾蚴(20±2条)贴于小鼠腹部。感染后6周或12周处死小鼠。

1.2 肝脏肉芽肿细胞的分离

1.2.1脱颈处死小鼠后， 75%乙醇浸泡 3 min，无菌取出约1 g的肝脏放入青霉素瓶中。

1.2.2加入100 μL下述不同浓度的Ⅳ型胶原酶溶液，眼科剪剪碎肝组织呈糊状(约10 min)。

1.2.35 mL的生理盐水重悬剪碎的肝组织，待肉芽肿颗粒自然下沉即吸去浑浊上清，再加入生理盐水重悬，并吸去上清，如此反复自然沉淀洗涤，直至上清清澈。

1.2.4收集感染6周的肉芽肿颗粒加入50 mL锥形瓶中：再分别加入10 mL含Ca2+/Mg2+和5%的胎牛血清的0.5 mg/mL、0.25 mg/mL和0.2 mg/mL的胶原酶溶液(Ⅳ型Solarbio)，37 ℃摇床消化，210 r/min，30 min；300目细胞筛过滤，小铁勺刮取细胞筛上的肉芽肿放入新锥形瓶中，再分别加入10 mL的上述浓度胶原酶溶液，37 ℃摇床消化，210 r/min，30 min。

1.2.5将雏形瓶置于冰上3 min终止消化，倒入无菌皿中，加入适量的完全1640培养基，用5 mL注射器反复吹，直至肉芽肿颗粒消失，300目细胞筛过滤至50 mL离心管中，离心，1 500 r/min，5 min，4 ℃。

1.2.6弃上清，加入5 mL红细胞裂解液，冰上10 min，再加入10 mL的不完全1640终止裂红，上下颠倒离心管混匀。离心，1 500 r/min，5 min，4 ℃，弃上清。不完全1640培养基离心洗涤2次，1 mL完全1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为4×106～6×106个/mL，400目尼龙网过滤悬液以去除虫卵，用于流式检测。

1.2.7胶原酶消化时间和浓度的调整：感染6周小鼠肝脏，先固定消化时间不变(两步消化时间为30/30 min)，改变胶原酶浓度(分别为0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL)，37 ℃摇床，210 r/min进行消化，获取肉芽肿细胞，标记抗体进行流式检测，结果表明0.25 mg/mL为最佳浓度。然后选择0.25 mg/mL胶原酶浓度来设置不同的消化时间分别为30 min与30 min、40 min与20 min和30 min与20 min，并据流式结果确定最佳消化时间，感染12周小鼠肝脏，分别采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的酶溶液消化，两次时间为40 min与30 min。

1.3流式细胞术检测肉芽肿细胞 肉芽肿细胞5×106个/管，大鼠血清20 μL，室温封闭20 min。加入1 μL FITC-CD4抗体/管(BD公司)，4 ℃，避光孵育40 min。染色缓冲液洗涤，350 μL的流式固定液重悬、固定细胞。流式仪检测。

1.4天狼猩红染色 留取肝脏组织，4%的多聚甲醛溶液固定24 h，浸腊、包埋，切片厚度5 μm，脱蜡至水,做常规天狼猩红染色。

1.5数据处理 所有数据均用SPSS16.0 软件包处理, 三组数据比较采用方差分析, 两组间比较采用t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肝脏的大体图 感染6周的小鼠肝脏表面可见很多粟粒样肉芽肿颗粒如图1A，而感染12周的小鼠肝脏表面肉芽肿颗粒较多但较小，且肝脏颜色更深，呈深褐色见图1B。

A. 感染6周； B. 感染12周图1 小鼠感染血吸虫后病变肝脏Fig.1 Photography of livers in mice infected with S. japonicum

2.2肝脏纤维化观察 红色为天狼猩红所染的纤维化组织，感染6周的小鼠肝脏肉芽肿见图2A，此时肝脏纤维化程度轻、面积较小；感染12周的肝脏，纤维化面积增大见图2B。

A. 感染6周； B. 感染12周图2 小鼠感染血吸虫后的肝脏纤维化(天狼猩红染色, ×100)Fig.2 Hepatic fibrosis in mice infected with S. japonicum (Sirius red staining, ×100)

2.3获得干净的肝脏肉芽肿及肉芽肿细胞 如图3A、B所示，第一步胶原酶消化后获得干净的肉芽肿。镜下可见大量围绕虫卵的肉芽肿细胞如图3B。经过第二步胶原酶消化后获得干净的活肉芽肿细胞见图3C。

A. 肉芽肿颗粒； B. 肉芽肿颗粒镜下图(×200)； C. 肉芽肿细胞(×400)图3 肝脏肉芽肿颗粒及肉芽肿细胞Fig.3 Hepatic granulomatous granules and cells

2.4 流式检测肉芽肿细胞

2.4.1 感染6周的肝脏肉芽肿

2.4.1.1胶原酶浓度的探索 分别采用0.20 mg/mL、0.25 mg/mL、0.50 mg/mL Ⅳ型胶原酶进行消化，消化时间均为30 min /30 min，获取肉芽肿细胞，标记抗体后进行流式检测。结果表明，0.25 mg/mL酶溶液消化下，可获得较高比例的CD4+T细胞且CD4+T细胞分群明显如图4A、B。统计结果见图4C, *P<0.05 为差异有统计学意义。因此，选择胶原酶最佳浓度为 0.25 mg/mL，用于探索消化时间。

图4 不同胶原酶浓度分离感染6周肝脏肉芽肿细胞的效果Fig.4 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

2.4.1.2消化时间的优化 在确定胶原酶最佳浓度为0.25 mg/mL后，调整消化时间为：30 min /30 min，30 min /20 min，40 min /20 min，粒细胞和淋巴细胞流式图见图5A。结果表明，在使用0.25 mg/mL的Ⅳ型胶原酶浓度条件下，第一次消化时间为30 min，第二次消化时间为20 min时，CD4+T细胞分群最佳，但细胞比例较低，见图5B；当第一次消化时间增加至40 min时，可获得更多CD4+T细胞，但CD4+T细胞分群不明显，见图5C；而当两次消化均为30 min时，可获得数量较多且分群明显的CD4+T细胞。

图5 不同消化时间分离感染6周肝脏肉芽肿细胞的效果Fig.5 Effects of different digestion periods on the isolation of hepatic granuloma cells from 6-week infection livers

2.4.2流式检测感染12周小鼠肝脏肉芽肿细胞的分离效果 血吸虫感染小鼠随着病情进展，肝脏逐渐出现纤维化，由于大量胶原沉积，此时分离肉芽肿细胞应该使用更高浓度的酶消化液，消化时间也应适当延长。再分离急性肉芽肿细胞得所获结果基础上，分别采用0.5 mg/mL和0.3 mg/mL的Ⅳ型胶原酶消化，第一次消化时间40 min，第二次消化时间30 min的条件下，粒细胞和淋巴细胞流式图见图6A。使用0.5 mg/mL的Ⅳ型胶原酶溶液，最终分离所获的CD4+T细胞难以分群，见图6B；且不获得更多的淋巴细胞，见图6C。因此，浓度为0.3 mg/mL的Ⅳ型胶原酶分离感染后12周肝脏肉芽肿细胞效果较好。由于已获得较为满意的分离效果，对于消化时间未做其它调整。

图6 不同胶原酶浓度消化分离感染12周肝脏肉芽肿细胞的效果Fig.6 Effects of different collagenase concentrations on the isolation of hepatic granuloma cells from 12-week infection livers

3 讨 论

宿主感染血吸虫后，机体会逐渐产生一系列的免疫防御反应，CD4+T细胞具有重要作用，CD4+T细胞分化的Th1、Th2、Treg和Th17等细胞在血吸虫感染后的不同阶段参与免疫应答，分泌的细胞因子相互调控参与机体免疫应答[8]。在血吸虫感染动物模型中，早期主要形成Th1型免疫应答[9]，晚期会转化，以Th2型细胞因子为主的免疫应答环境[10-11]；而Treg细胞已被证明可使血吸虫感染由急性转为慢性感染[12-13]；Th17细胞参与了虫卵导致的急性肉芽肿和肝纤维化，而且IL-17和IFN-γ在血吸虫感染过程中相互调节[14-16]。因此，获得足量、纯净的肝脏肉芽肿活细胞，特别是细胞表面标志保存完整的CD4+T细胞对于血吸虫性肝脏疾病的细胞学的研究至关重要。

Pellegrino等采用匀浆机破碎肝脏，然后生理盐水反复洗涤、自然沉淀的方法获得肉芽肿组织，缺点是肉芽肿上仍附着有肝组织[17]；Ragheb等采用上述方法获得肉芽肿组织后，采用Ⅳ型胶原酶和DNase I在37 ℃水浴摇床消化肉芽肿颗粒30～50 min分离曼氏血吸虫感染8周和20周的CBA/J小鼠[4]。Metwali等采用0.5%的Ⅳ型胶原酶37 ℃水浴摇床消化30～40 min分离曼氏血吸虫感染8周CBA/J小鼠的肝脏肉芽肿细胞[18-19]。以上这些分离肉芽肿细胞的方法存在不同的缺陷：如肉芽肿细胞不纯(含有肝浆)；或是细胞表面标志丢失；或是细胞的活性降低影响后续实验。

研究表明日本血吸虫与曼氏血吸虫治病力不同，如曼氏血吸虫感染C57BL/6小鼠仅产生较小的肝脏肉芽肿，而感染CBA/J小鼠则发生强烈的肉芽肿反应，程度与日本血吸虫感染的C57BL/6小鼠相似，因而上述关于曼氏血吸虫肉芽肿细胞分离方法不适用于分离日本血吸虫肉芽肿细胞。本研究在Yole[20]建立的Ⅳ型胶原酶两步消化法分离肉芽肿细胞的基础上，对胶原酶浓度和消化时间进行探索，建立了针对日本血吸虫感染C57BL/6小鼠急、慢性肝脏肉芽肿细胞分离的有效方法。通过第一步胶原酶消化，去除了肉芽肿周围的肝组织，过滤后得到了干净的肉芽肿颗粒；通过第二步胶原酶消化和注射器机械吹打，有效地分散了组成肉芽肿的各种细胞。

感染6周的小鼠肝脏肉芽肿细胞流式检测的结果显示，稍高的胶原酶浓度或者过久的消化，都会导致CD4+T细胞分群不明显，而过低的胶原酶浓度也无法分离出足够CD4+T细胞，所以对于感染了6周小鼠的肝脏，建议采用0.25 mg/mL的胶原酶消化液，两步消化时间为30 min/30 min，此时CD4+T细胞比例高且细胞分群明显。随着感染时间的推移，肝脏肉芽肿炎症由急性感染转化为慢性感染并伴随有肝纤维化，肝脏的胶原含量会逐渐增多(天狼星红染色结果可见)，因此，需要改变胶原酶浓度和消化时间。结果表明：分离感染12周的小鼠肝脏肉芽肿细胞最佳胶原酶浓度为0.3 mg/mL的酶浓度，分离的CD4+T细胞比例较高，且分群明显；而使用0.5 mg/mL的胶原酶浓度则会破坏CD4+T细胞表面蛋白，且细胞分群不明显。

本研究提供的分离肉芽肿细胞的方法可重复性好，步骤简单易操作；整个过程不超过2 h；不需要淋巴细胞分离液等试剂辅助纯化；可以包括粒细胞在内的组成肉芽肿的主要细胞群；而且细胞纯度高、活性好(台盼蓝染色细胞活性达95%)，获得肉芽肿细胞，完全可以满足后续实验(如刺激培养、流式分选等)的要求。可广泛地用于日本血吸虫肝脏肉芽肿疾病的细胞免疫研究，特别是为进一步研究肉芽肿细胞中的Th1、Th2、Th17和Treg等辅助性T细胞的提供了一种可靠的CD4+T细胞分离技术。