福建省沙门菌毒力基因sitC及iroN分布特征分析

黄梦颖，陈建辉，邱玉锋，杨劲松，陈爱平

沙门菌是一种常见的食源性肠道致病菌。其宿主范围广泛，人一经感染会引发一系列的病症，包括轻微的肠胃炎，严重的甚至引起全身性感染。即使临床治愈后，约3%的患者胆囊中仍携带沙门菌，并且可持续由粪便排泄达1年及以上，成为重要的传染源[1]。沙门菌中存在许多毒力因子，如毒力基因及其产物[2]，能刺激宿主细胞产生一系列反应，使其能侵入宿主细胞，并在其中生长繁殖。目前，已有研究对毒力基因invA及spvB在福建省沙门菌分离株中的分布情况进行了报道[3]。本文对福建省分离的腹泻患者与健康人群沙门菌菌株进行毒力基因sitC及iroN的扩增检测，以便了解福建省沙门菌sitC及iroN毒力基因分布情况。

1 材料与方法

1.1菌株来源 本实验涉及的沙门菌来自福建省其它感染性腹泻监测点及福建省属食品从业人员健康体检。其中，腹泻患者以鼠伤寒、肠炎和斯坦利血清型最为常见。健康人群以德尔卑和肠炎血清型最为常见。所以本实验选取鼠伤寒、肠炎、德尔卑及斯坦利4种血清型，共166株沙门菌；其中腹泻患者121株、健康人群45株。

1.2试剂与仪器 本实验所用培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；PCR反应试剂、DL2000 Marker购自Takara公司；琼脂糖、溴化乙锭(10 mg/mL)等购自上海生工。 Veriti Dx扩增仪(AB applied biosystems公司)；Basic电泳仪；Gel Doc XR+凝胶成像系统。

1.3 试验方法

1.3.1菌株的分离鉴定 参照《感染性腹泻诊断标准》(WS271-2007)、《从业人员预防性健康检查沙门菌、志贺菌检验方法》(WS/T454-2014)提供的方法进行分离鉴定。

1.3.2引物设计 引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列及扩增片段长度[4]见表1。

1.3.3细菌DNA提取 采用煮沸法提取。刮取适量分离纯化后的菌落于纯水中制成300 μL菌悬液。100 ℃煮沸10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清作为PCR模板。

1.3.4PCR反应体系及扩增条件 采用20 μL反应体系：Ex Taq DNA聚合酶0.5 U，dNTP 200 μmol/L，上游引物0.4 μmol/L，下游引物0.4 μmol/

表1 PCR引物
Tab.1 PCR primers

基因引物序列(5'-3')目的片段长度(bp)sitCF-CAGTATATGCT-CAACGCGATGTGGGTCTCC768R-CGGGGCGAAAATAAAG-GCTGTGATGAACiroNF-ACTGGCACGGCTCGCT-GTCGCTCTAT1205R-CGCTTTACCGCCGTTCTGC-CACTGC

L，DNA模板2 μL。扩增条件：预变性94 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s、55 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s，30个循环，总延伸72 ℃ 5 min。

1.3.5PCR扩增产物的检测 将取5 μL PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，Gel Doc XR+凝胶成像系统观察拍照。

1.3.6统计分析 运用SPSS 17.0进行数据的整理与分析，组间比较采用卡方检验，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1毒力基因sitC及iroN的检出情况 166株沙门菌分离株中检出含有毒力基因sitC及iroN的菌株数分别为86株和66株，总检出率分别为51.81%(86/166)和39.76%(66/166)。

从血清型来看，鼠伤寒、肠炎、德尔卑和斯坦利四种血清型沙门菌中也均检出了一定比例的毒力基因sitC及iroN。sitC毒力基因在鼠伤寒、肠炎、德尔卑和斯坦利4种血清型的检出率分别为：36.62%、63.64%、65.22%、58.82%；iroN的检出率分别为：26.76%、52.73%、60.87%、23.53%。经卡方检验分析，这2个毒力基因在4种血清型中的检出率差异有统计学意义(χ2sitC=11.634，P=0.009；χ2iroN=15.020，P=0.002)。具体见表2、表3。

表2 不同组别各血清型沙门菌毒力基因sitC的检出情况
Tab.2 Detection of Salmonella virulence gene sitC in different groups

鼠伤寒肠 炎德尔卑斯坦利合 计阳性数(标本数) 检出率(%) 阳性数(标本数) 检出率(%) 阳性数(标本数)检出率(%) 阳性数(标本数) 检出率(%) 阳性数(标本数) 检出率(%) 腹泻患者23(61)37.7025(42)59.524(5)80.009(13)69.2361 (121)50.41健康人群3(10)30.0010(13)76.9211(18)61.111(4)25.0025(45)55.56 合 计26(71)36.6235(55)63.6415(23)65.2210(17)58.8286(166)51.81

表3 不同组别各血清型沙门菌毒力基因iroN的检出情况
Tab.3 Detection of Salmonella virulence gene iroN in different groups

鼠 伤 寒肠 炎德 尔 卑斯 坦 利合 计阳性数(标本数)检出率(%)阳性数(标本数) 检出率(%) 阳性数(标本数) 检出率(%) 阳性数(标本数) 检出率(%) 阳性数(标本数) 检出率(%)腹泻患者16 (61)26.2320 (42)47.623 (5)60.004 (13)30.7743 (121)35.54 健康人群3 (10)30.009 (13)69.2311 (18)61.110 (4)0.0023 (45)51.11 合 计19 (71)26.7629 (55)52.7314 (23)60.874 (17)23.5366 (166)39.76

2.2毒力基因sitC及iroN的携带模式情况 从腹泻患者及健康人群的粪便标本中分离到的沙门菌中，毒力基因sitC及iroN携带模式的分布差异无统计学意义(Fisher’s确切概率P=0.067)。在两个组别中，sitC+iroN+及sitC-iroN-都是最常见的携带模式。具体见表4。

表4 不同组中沙门菌毒力基因sitC及iroN的携带模式情况
Tab.4 Carrying patterns of Salmonella virulence genes sitC and iroN in different groups

sitC+iroN+sitC+iroN-sitC-iroN+sitC-iroN-阳性数(标本数) 构成比(%)阳性数(标本数) 构成比(%)阳性数(标本数) 构成比(%)阳性数(标本数) 构成比(%)腹泻患者41(121)33.88 20(121)16.532(121)1.6558(121)47.93 健康人群23(45)51.112(45)4.440(45)0.0020(45)44.44

3 讨 论

繁殖决定因素是细菌致病力的重要决定因子之一，其多数与细菌的营养相关。为了生存繁殖，沙门菌必须拥有从宿主细胞内获得营养元素的能力。其中一种重要的营养元素就是铁离子[5]。当沙门菌入侵时，宿主会编码高亲和力的铁结合蛋白作为非特异性防御机制阻止沙门菌入侵。所以，沙门菌也形成了一套精细、复杂且高亲和的铁离子摄取系统以保证在铁缺乏的环境中也能快速繁殖[6]。目前研究已发现了许多铁离子摄取系统。其中sitABCD系统位于沙门菌63’处的毒力岛I上[5-6]。sitC是sitABCD家族的一员，其编码一种通透酶[6]。在富含铁离子的环境中，sitC操纵子的转录受到Fur的抑制[6]。iroN也位于沙门菌染色体上，其编码的铁载体蛋白位于外膜上，是沙门菌特有的抗原，有利于沙门菌在土壤里生长繁殖[7]。iroN可能与食源性沙门菌病的暴发有关[8]。本文就选取了这2个与铁摄入相关的毒力基因进行研究。

熊海平等对南通市沙门菌毒力基因分布的研究中发现sitC和iroN这两个基因在所有分离株中都存在[9]。而其他的一些研究中，这两个基因的检出率也都高达90%以上[10-12]。而本研究的结果显示，福建省沙门菌分离株中毒力基因sitC和iroN的检出率只有51.81%和39.76%，比上述报道的要低。这可能是由于不同地区、不同来源的沙门菌分离株毒力基因分布存在一些差异。

在对鸟类[4]和火鸡[13]中分离的沙门菌菌株的研究中发现毒力基因sitC和iroN在患病及健康两个组别中的分布不存在差异。这一发现与本文研究的结果是一致的。在本文的研究中，这两个基因在福建省腹泻患者和健康人群中的分布也不存在显著差异。但是，在对猪[10]中分离的沙门菌菌株的研究中发现，从患病的猪中分离到的沙门菌菌株中iroN的携带率明显高于健康的。而sitC并无差异。另有发现表明iroN与从引起沙门菌病爆发的食物中分离到的沙门菌菌株正相关[8]。这就预示着这两个基因在发病机制中所起的作用可能是不一样的。sitC可能更倾向于帮助沙门菌在宿主体内生长繁殖。而iroN可能不仅有助于沙门菌的生长繁殖，而且还与沙门菌的致病性相关。本研究从健康人群中分离出的沙门菌菌株数较少，研究结果可能会有偏差，今后我们将加大标本量进一步验证。

沙门菌的部分毒力基因在不同血清型中的存在情况会有所不同。但是，现有的报道中毒力基因sitC和iroN的存在情况并不存在血清型差异[9-12]。有趣的是本研究中，沙门菌的这2个毒力基因sitC和iroN在鼠伤寒、肠炎、德尔卑和斯坦利4种血清型中的分布存在显著差异。其中，德尔卑沙门菌中检出率最高，分别为65.22%和60.87%；其次是肠炎沙门菌，分别为63.64%和52.73%；而鼠伤寒沙门菌中这两个基因的检出率都不高，分别为36.62%和26.76%。2003年以前，鼠伤寒沙门菌和德尔卑沙门菌是福建省腹泻病人和健康人群中检出率最高的两种血清型沙门菌[14]。近年来这一趋势有所变化，福建省沙门菌中检出率最高的血清型是鼠伤寒，其次是肠炎，德尔卑虽仍是本省优势血清型，但检出率较2003年以前已有所下降[15-17]。健康人群中检出率最高的沙门菌血清型也仍是德尔卑[17]。另外，福建省鼠伤寒沙门菌在儿童中的检出率明显高于成年人；而肠炎沙门菌在儿童和成年人中的检出率差不多。由此可见，第一，基因sitC和iroN可能与沙门菌的生长繁殖有一定关系；第二，鼠伤寒沙门菌中可能存在其他替代机制帮助其摄入铁离子[5]；第三，沙门菌在儿童和成年人体内生长繁殖及致病机制可能存在差异。上述几点还需要更多的实验证据进行进一步验证。

另一方面，在本省的沙门菌分离株中sitC和iroN的基因携带模式在腹泻病人和健康人群两个组别中的差异无统计学意义，sitC+iroN+及sitC-iroN-都是最为常见的携带模式。sitC-iroN-模式的常见也进一步说明了其他替代机制的存在弥补了这些基因缺失所带来的影响，使沙门菌仍然能在宿主体内生存并快速繁殖。

综上所述，福建省沙门菌分离株中均检出了一定比例的sitC和iroN毒力基因。这两个毒力基因的分布存在血清型差异，但在健康人群和腹泻病人的沙门菌分离株中不存在分布差异。所以福建省健康人群的沙门菌分离株与腹泻病人的沙门菌分离株一样都具有较强的生存能力和一定的致病潜能。因此，应该加强对沙门菌的检测、预警，制定科学有效的防控措施，同时规范食品卫生管理，加大食品安全相关知识的宣传力度，做好食品从业人员健康体检，对检出的健康带菌者应劝其及早配合治疗并暂时离开岗位，以避免他们成为疾病的传染源，造成沙门菌病的暴发。