GRIM-19在银屑病皮损中的表达及维A酸对其影响的研究

吴 娜，郑 焱，李昌吉

银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病，近年来发现除皮肤损害外，该病还可引起其他系统损害[1]，影响患者健康，但目前其发病机制尚不明确，治疗方法需要更多探索。银屑病主要表现有表皮角质形成细胞过度增殖，真皮新生血管形成，炎症因子浸润。 干 扰 素（interferon，IFN）/维A酸（retinoic acid，RA）联合应用诱导细胞凋亡相关基因19（genes associated with retinoid interferon induced mortality，GRIM-19）是近些年新发现的能够参与细胞增殖、诱导凋亡过程的基因[2]。目前研究表明，GRIM-19在人类多种正常组织中表达，能够参与IFN/RA调节细胞增殖凋亡过程，但其在银屑病皮损中的表达如何尚不清楚。本研究拟通过免疫组化法检测寻常性银屑病患者皮损组织中GRIM-19蛋白的表达，并将维A酸作用于银屑病皮损，观察作用前后皮损中GRIM-19表达的变化，从而深入研究GRIM-19在银屑病发生发展及维A酸治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例 寻常性银屑病患者43例，男21例，女22例；年龄17～63岁，平均年龄（37.72±10.72）岁。入选标准：①已经临床及组织病理明确诊断；②无其他皮肤病及系统性疾病；③本次发作病程1～3周；④患者本次发作未接受任何治疗。排除标准：①对受试药物过敏者；②孕妇及哺乳期妇女。对照取自20例外科手术切下的胸腹部正常皮肤，男女各10例；年龄12～51岁，平均年龄（31.80±12.32）岁。两组年龄、性别等一般状况差异无统计学意义（t=1.945，χ2=0.007，P均＞0.05）。本研究通过陕西省人民医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.1.2 试剂 GRIM-19兔抗人单克隆抗体（英国Abcam公司），工作浓度1:200；羊抗兔免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 采用随机化区组分组抽取银屑病患者给予维A酸（0.1%他扎罗汀乳膏）或氧化锌软膏[3,4]，每日1次外用，连用4周。治疗结束后所有患者双盲分组，其中试验组21例，男11例，女10例，年龄16～57岁，平均（35.76±11.07）岁，其余22例为对照组，男10例，女12例，年龄18～63岁，平均（39.59±10.28）岁，两组年龄、性别等一般状况差异无统计学意义（t=1.176，χ2=0.206，P均＞ 0.05），用药前，用药后2周、4周均手术切取皮损组织。

1.2.2 免疫组化染色 新鲜组织取材后甲醛固定，常规包埋，切片乙醇逐级脱蜡、水化。使用含10%正常血清及1%牛血清白蛋白的三乙醇胺缓冲溶液室温封闭2 h；加入一抗在4 ℃下于冰箱孵育过夜；含0.3%过氧化氢的三乙醇胺缓冲溶液中孵育15 min，以封闭内源性过氧化物酶活性；加入辣根过氧化物酶偶联的二抗于室温下孵育1 h，DAB显色10 min，冲洗，苏木精复染，阴性对照中用PBS代替一抗。具体操作按说明书进行。

1.2.3 结果判断标准 阳性表达为细胞质或细胞核中出现黄色、棕黄色或褐色颗粒。通过计分对结果进行综合判定。具体方法为在400倍镜下随机选取5个视野，首先按照细胞阳性率来计分，≤5%计0分，＞5%且≤25%计1分，＞25%且≤50%计2分，＞50%且≤75%计3分，＞75%计4分；再根据染色强度分级来计分，不着色计0分，淡黄色计1分，浅棕黄色计2分，大量棕褐色计3分；最后将每个视野阳性细胞百分率得分与染色强度得分相乘得到该视野最终计分，以5个视野得分的平均值为最终结果。按照最终得分0～1分为阴性（-），2～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件分析数据，Kruskal-wallis检验对银屑病皮损中GRIM-19的表达和维A酸治疗前后试验组GRIM-19的表达进行分析，计量资料用均数±标准差 表示,数据经过检验，符合正态分布且方差齐，两组间t检验和χ2检验对年龄和性别差异进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银屑病皮损与正常皮肤GRIM-19的表达

GRIM-19主要定位于细胞质线粒体中，细胞核中有少量表达[5]。正常皮肤组织中GRIM-19蛋白为棕色颗粒，表达于全层表皮，主要存在于表皮角质形成细胞胞质中，少数存在于细胞核内（图1a）；银屑病边缘皮损中GRIM-19蛋白为淡黄色颗粒，表达于表皮基底层和棘层，染色较正常皮肤组织减弱（图1b）；银屑病中间皮损中GRIM-19几无表达（图1c）。对各组进行比较，差异有统计学意义（表1）。

表1 银屑病皮损与正常皮肤GRIM-19的表达 （例）

2.2 维A酸对皮损GRIM-19表达的影响

图1 银屑病皮损与正常皮肤免疫组化组织病理（SP法×400）

维A酸治疗前银屑病皮损表皮全层细胞中几乎无GRIM-19表达（图2a），维A酸治疗2周后皮损局部表皮基底层和棘层细胞中可见淡染的棕黄色颗粒（图2b），维A酸治疗4周后皮损变薄，鳞屑减少，全层细胞中可见深棕黄色颗粒（图2c）。对照组处理前后皮损染色未发生明显改变。试验组维A酸处理前、处理2周和4周后 GRIM-19表达情况见表2。

图2 他扎罗汀乳膏治疗前后银屑病皮损免疫组化组织病理（SP法×400）

表2 维A酸治疗前后试验组GRIM-19的表达

3 讨论

GRIM-19是一种参与IFN/RA调节细胞凋亡的基因，其由Angell等在2000年用基因敲除技术分离筛选出来的。目前已发现GRIM-19在心脏、骨骼肌等多种正常组织中有明显表达，参与细胞增殖、凋亡的调控过程，而在胃癌、肝癌等多种恶性肿瘤中呈低表达或缺失状态[6,7]。有学者推测其表达的降低或者位点的突变可能是导致细胞异常增殖和恶性转化的重要因素[8,9]。银屑病作为一种具有表皮异常增生特点的皮肤病，笔者的研究发现GRIM-19在正常皮肤组织中表达于表皮全层，在银屑病边缘皮损中表达于表皮基底层和棘层，且表达强度较正常皮肤减弱，在银屑病中间皮损中不表达。 研究提示，维A酸对多种与细胞增殖分化有关的因子有重要调控作用[10]，其对表皮角质形成细胞起到调节增殖、诱导分化的作用。本研究同时用维A酸治疗银屑病，观察其对GRIM-19表达的影响。结果显示治疗前银屑病皮损表皮角质形成细胞中几乎不表达GRIM-19，经过2周和4周的治疗，随着临床症状的好转，皮损中GRIM-19表达逐渐升高，此时与对照组相比有明显差异。因此，推测GRIM-19可能参与银屑病表皮细胞异常增殖、凋亡，是维A酸治疗银屑病过程中的重要影响因子。

Janus蛋白酪氨酸激酶（Janus protein tyrosine kinase, JAK）/信号传导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription, STAT）途径作为细胞因子信号转导的主要途径，在银屑病表皮细胞增殖凋亡中发挥着重要的调节作用。研究得知，STAT3的反式激活结构域尤其是其中第727 位上的丝氨酸残基是GRIM-19的特异结合位点，因此，GRIM-19即通过与STAT3的相互作用，阻碍其核转位，进而抑制依赖STAT3的下游靶基因的转录，影响细胞增殖[7,11,12]。推测在银屑病发病初期，GRIM-19表达逐渐减少，与STAT3结合减弱，继而启动JAK-STAT信号转导通路，调节下游靶基因Bcl-2、cyclin、c-myc、c-Jun、Fas、VEGF 等的转录表达，导致细胞异常增殖、凋亡、血管增生，从而导致银屑病的发生和发展。

以往的研究发现，维A酸可在肺间质纤维化、宫颈癌等多种疾病中诱导STAT3表达下降[13,14]，且在胃腺癌的研究中进一步发现维A酸可下调JAKSTAT信号通路下游靶基因B淋巴细胞瘤（B cell lymphoma，Bcl）-2的表达[15]，据此推测，维A酸对银屑病的治疗很可能通过提高GRIM-19的表达，继而抑制JAK-STAT信号转导通路及其下游靶基因的转录表达，导致细胞增殖、分化、凋亡趋于正常化。因此，GRIM-19可能是维A酸治疗银屑病的关键作用因子。

综上所述，GRIM-19在银屑病患者皮损中表达下调，维A酸处理银屑病皮损可提高GRIM-19的表达，提示未来GRIM-19可作为生物标志用于监测临床疗效，通过外源性导入GRIM-19，阻断STAT3信号通路，为银屑病的治疗可能开辟新的思路。