窄谱中波紫外线治疗对寻常性银屑病患者Th17/Treg失衡的影响

王惠琳，孟继龙，张伟伟，张 楠

银屑病是由T淋巴细胞介导的免疫相关的慢性炎症性皮肤病，主要以角质形成细胞的异常过度增殖为特征，因其有着无法预知的疾病缓解期及不能完全理解的行为模式，带来了严重的社会及经济负担。目前的研究进展表明，CD4+T淋巴细胞，特别是T辅助（Th）17亚群和调节性T淋巴细胞（Treg）之间的不平衡可能是银屑病发展的关键之一，因此Th17/Treg细胞可能是一种新的治疗靶点[1]。国内外已将窄谱中波紫外线（narrow-band ultraviolet，NBUVB）广泛用于银屑病的治疗，并已取得良好的效果，然而其中的机制并未完全明了。本研究通过流式细胞仪检测银屑病患者及健康对照者外周血Th17细胞和Treg细胞的比例，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测患者血清中白细胞介素（IL）-17及转化生长因子β1（TGF-β1）的水平。通过研究NB-UVB治疗银屑病前后Th17/Treg细胞及其相关因子的表达影响，初步探讨NB-UVB治疗银屑病的机制及临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例与标本

入选2015年10月—2017年8月在本院皮肤科门诊就诊及住院确诊的67例寻常性银屑病患者，年龄18～60岁，平均年龄25.69岁，病程6个月～25年，平均病程8.63年。20名正常健康者作为对照组，年龄18～60岁，无性别限制。健康对照组与患者组一般资料比较、性别及年龄上差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。采集患者NB-UVB治疗前后及健康对照组外周血标本。

1.1.1 入选标准 ①所有患者均符合《中国临床皮肤病学》[2]诊断标准，均为进行期患者，其中58例经过组织病理检查确诊。②皮损面积＞10%及银屑病皮损面积及严重度指数（PASI）评分≥10分的中、重度寻常性银屑病入组。③所有患者入选时1个月内未接受过局部外用药，3个月内未系统使用过免疫抑制剂、糖皮质激素和维A酸等药物治疗，无其他免疫性皮肤病及肺、肝、肾等系统性疾病。④已签署知情同意书。

1.1.2 排除标准 ①患者有光敏性皮肤病或有因阳光照射后加重或诱发的疾病等。②孕妇及哺乳期妇女。③有精神、神经疾病患者。④近1月内服用过光敏性药物者。⑤因某些原因未能完成治疗方案及随访的患者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 NB-UVB治疗使用上海Sigma公司窄谱中波紫外线光疗仪（SS-05），波长为310～315 nm，峰值311 nm，全身照射。照射前充分暴露皮损部位，面部及外生殖器部位覆盖遮挡，照射距离15～30 cm。采用SUV-1000日光紫外线模拟测定患者皮肤NB-UVB的最小红斑量（minimal erythema doses，MED），确定首次剂量为MED平均值的70%，即0.3 J/cm2,每周3～5次，后续光疗剂量在前次剂量基础上按局部皮肤反应依次递增10%～50%，至光疗区皮肤出现淡红斑时则维持该剂量进行治疗。治疗过程中若出现疼痛性红斑或水疱时停止光照，至皮损恢复后再继续照射，此时剂量为前次剂量的50%，最大剂量为2.0 J/cm2，20次为1个总疗程，若照射过程中患者痊愈，则延长照射间隙（每周1～2次），直至疗程结束。

1.2.2 主要仪器及试剂 CANTO-I，PerCP-CyTM5.5 mouse anti-human CD3，FITC mouse anti-human CD4，APC mouse anti-human CD25，PE mouse anti-human CD127，APC mouse anti-human CD183，PE mouse anti-human CD196（CCR6），红细胞裂解液、 细胞固定破膜液、人淋巴细胞分离液等（美国，BD）；ELESA试剂盒（美国，eBioscience）等。

1.2.3 流式细胞仪检测Th17/Treg 肝素钠真空抗凝采血管取人外周血全血1～2 ml，4 ℃放置，8 h内进行检测；Th17细胞样本管各加入200 μl抗凝全血，后 加 入 5 μl PerCP-Cy™5.5 mouse anti-human CD3，5 μl FITC mouse anti-human CD4，5 μl APC mouse anti-human CD183，5 μl PE mouse anti-human CD196避光孵育30 min，同时设置同型对照管，进行细胞表面标志染色。 孵育后进行红细胞裂解，然后洗涤细胞，每管加入300 μl缓冲液充分混匀细胞，可上机检测，界定CD3+CD4+CD183-CD196+为Th17细胞。Treg细胞样本管分别加入200 μl 抗凝全血,向样本管加入 5 μl FITC mouse anti-human CD4，APC mouse anti-human CD25，5 μl PE mouse anti-human CD127，同时设置同型对照管，避光孵育30 min，进行细胞表面染色标记。孵育后裂解红细胞，洗涤细胞后离心弃上清，取300 μl缓冲液混匀细胞可上机检测，界定CD4+CD25+CD127+为Treg细胞。

1.2.4 ELISA检测IL-17和TGF-β1浓度 非抗凝管采空腹静脉血3 ml，3 000 r/min，10 min分离上清液，并置于离心管中，-70℃保存，备用，避免反复冻融，按照试剂盒说明进行操作。

1.3 统计学方法

使用SPSS23.0统计学软件处理数据，采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05有统计学意义；相关性分析采用Person相关分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 银屑病患者和健康对照者外周血 Th17/Treg 细胞比例检测

寻常性银屑病患者NB-UVB治疗前外周血Th17细胞比例及Th17/Treg比值明显高于健康对照组（P

2.2 银屑病患者和健康对照者外周血 IL-17 和TGF-β水平

图1 Th17细胞流式细胞仪检测图

表1 外周血Th17细胞及Treg细胞比例及Th17/Treg水平比较 （±s，%）

表1 外周血Th17细胞及Treg细胞比例及Th17/Treg水平比较 （±s，%）

注：与健康对照组比较，*P＜0.01；与治疗后比较，#P＜0.01

组 别 例数 Th17 Treg Th17/Treg健康对照组 20 6.23±2.43 8.09±3.64 0.85±0.30银屑病组治疗前 67 12.61±4.41*# 4.83±1.92*# 3.33±2.08*#银屑病组治疗后 67 7.93±2.56 7.34±2.53 1.16±0.44

寻常性银屑病患者NB-UVB治疗前IL-17血清水平明显高于健康对照者（P＜0.01），血清TGF-β1水平较健康对照者明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。寻常性银屑病患者NB-UVB治疗后血清IL-17及TGF-β1水平与健康对照者相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。＜0.01），外周血Treg细胞比例明显低于健康对照组（P＜0.01）。寻常性银屑病患者NB-UVB治疗后外周血Th17细胞比例及Th17/Treg比值明显低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.01），外周血Treg细胞比例较治疗前明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。寻常性银屑病患者NB-UVB治疗后外周血Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比值与健康对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1、图2，表1）

表2 外周血IL-17 和TGF-β1水平比较（±s，pg/ml)

表2 外周血IL-17 和TGF-β1水平比较（±s，pg/ml)

注：与健康对照组比较，*P＜0.01；与治疗后比较，#P＜0.01

组 别 例数 IL-17 TGF-β1健康对照组 20 20.44±2.63 13.13±3.24银屑病治疗前 67 62.75±24.25*# 9.76±3.03*#银屑病治疗后 67 34.15±15.76 12.00±3.13

2.3 寻常性银屑病患者PASI评分与Th17、Treg细胞表达的相关性分析

本研究中寻常性银屑病患者PASI评分为（17.28±5.23）分，与外周血Th17比例、IL-17血清水平、Th17/Treg比例呈正相关性，r值分别是0.708，0.725，0.794，P值均＜0.01；PASI评分与Treg细胞比例、TGF-β1血清水平呈负相关性，r值分别是-0.508，-0.612，P值均＜0.01。

3 讨论

图2 Treg细胞流式细胞仪检测图

银屑病（psoriasis）是一种由多基因遗传决定的、多环境因素诱导的免疫异常性皮肤病，严重影响人们生活质量及心理健康，关于银屑病发病机制和治疗的研究始终是研究者关注的热点之一。银屑病发病原因复杂，近年来发现的新型Th细胞亚群及其细胞因子在银屑病发病机制中的作用得到了广泛的关注[3]。Th17细胞由初始CD4+T淋巴细胞分化而来，Th17细胞在防御胞外菌感染、介导慢性炎症和肿瘤发病中发挥重要作用。Th17产生IL-17、IL-6、IL-22及肿瘤坏死因子（TNF）-α等细胞因子，Th17常通过这些细胞因子形成复杂的免疫通路网络来发挥其作用。Th17主要效应因子IL17能够刺激角质形成细胞产生细胞因子、趋化因子及其他前炎症递质从而使IL-17A成为免疫系统维持慢性炎症的关键所在[4,5]。众多研究结果显示，Th17/IL-17在银屑病发病机制及银屑病炎症性皮损的发生中起着重要的作用。与Th17细胞功能相反却又相互关联的另一个重要的细胞即调节性T淋巴细胞（Treg），Treg可分为两种类型：自然细胞（tTreg），诱导细胞（iTreg），tTreg主要通过直接的细胞间接触发抑制功能，代表大部分稳态调节下的Treg细胞； iTreg主要通过分泌抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1等发挥作用[6]。研究表明，数量及功能的不足导致Treg细胞不能发挥其抑制抗原特异性CD4+T淋巴细胞增殖，不能优化辅助性T淋巴细胞亚型，诸如Th1/Th17 / Th22的分化，同时Treg细胞的监视功能消弱，使其不能发挥抑制炎性细胞的过度分化作用，这提示Treg细胞参与了诸如银屑病、特应性皮炎等炎症性皮肤病及皮肤肿瘤的发生及发展[7]。Th17细胞主要促进炎症及免疫反应，而Treg细胞主要是抑制免疫和免疫耐受，但这两种功能相反的细胞在不同的条件下又能够相互转化、相互支持，由此形成二者之间平衡的改变，在银屑病发病机制的研究中越来越受到人们的重视。

笔者的研究结果显示，寻常性银屑病患者外周血Th17细胞比例及血清中IL-17的表达水平较正常人明显升高；外周血Treg细胞的比例及血清中TGF-β1的表达水平明显低于正常人。寻常性银屑病患者与健康对照者相比，Th17/Treg细胞比例明显增高，同时Th17细胞比例及IL17水平的改变与寻常性银屑病患者PASI评分呈正相关，而Treg细胞比例及TGF-β1的表达水平与PASI评分呈负相关。结果提示Th17/Treg二者平衡的失常可能参与了银屑病的发病及进展。目前，通过抑制炎症反应及促进免疫耐受的途径来调控Th17/Treg及其细胞因子的异常表达的治疗，可能会为银屑病提供靶向治疗的思路[8,9]。

NB-UVB目前已普遍用于寻常性银屑病、白癜风等皮肤疾病治疗。NB-UVB治疗机制是直接诱导T淋巴细胞的凋亡，增加银屑病皮损处T淋巴细胞在局部的消耗，抑制表皮朗汉斯细胞的数量及功能，抑制淋巴细胞的增殖及NK细胞的活性，抑制免疫反应而达到治疗目的[2,10]。本研究结果显示，寻常性银屑病患者使用NB-UVB治疗后外周血Th17细胞比例、 Th17/Treg、IL-17的水平均较治疗前明显降低（P＜0.01），而Treg细胞比例、TGF-β1水平较治疗前明显增高（P＜0.01）。这提示NB-UVB治疗可能通过调整外周循环中Th17及Treg细胞的数量及功能来治疗寻常性银屑病。既往的研究结果提示，NBUVB的治疗能够减少炎性因子如IL-1、IL-2、IL-6等产生，同时促进抗炎性因子IL-10产生[10]。近年有学者研究结果显示，NB-UVB通过减少循环中Th1、Th17细胞的数量及抑制其免疫反应，上调具有免疫抑制作用的Treg细胞的水平数量及增加其免疫反应，通过抑制促炎性因子IL-17的产生并增加抗炎性因子TGF-β1表达水平，从而改变CD4+T淋巴细胞亚群分化而达到治疗寻常性银屑病的目的[11]。

综上所述， Th17和Treg细胞及其相关细胞因子的表达及功能的异常在寻常性银屑病的发病及病情进展中可能起着关键作用。NB-UVB通过抑制Th17的数量及功能，恢复Treg细胞的表达及抑制免疫反应功能，从而成为治疗寻常性银屑病的一种安全有效的方法。然而，寻常性银屑病患者Th17/Treg失衡的具体机制，NB-UVB改变外周血中Th17及Treg数量及相关细胞因子水平的具体机制仍需要进一步的深入研究。