葡萄枸杞复合果醋发酵工艺的研究

李彩霞，张睿睿

（河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000）

葡萄为葡萄科葡萄属木质藤本植物，其营养价值较高，富含钙、铁、钾、镁和胡萝卜素、核黄素、维生素C（vitamin C，VC）、葡萄糖、果糖、酒石酸、草酸等多种矿物质元素和营养成分。具有抗病毒杀菌、抑制肿瘤、抗贫血、降低胃酸、抗动脉粥样硬化、补益大脑和利尿消肿等保健功能；还具有缓解机体疲劳，降低血糖浓度，预防骨质疏松症，降压，抗氧化和美容等药理作用[1]。枸杞是茄科枸杞属植物，味甘、性平，属于卫生部公布的药食同源品种，在我国和其他的亚洲国家有超过2000年的种植和食用历史[2]。其含有丰富的枸杞多糖、β-胡萝卜素、维生素E（vitamin E，VE）、硒及黄酮类等抗氧化物质，有较好的抗氧化作用，此外还具有抗衰老、免疫调节、降血糖、降血脂等作用[3]。

果醋是用水果或果品的加工下脚料为主要原料，利用现代生物技术酿制而成的一种营养丰富、风味优良的酸味调味品，其兼有水果和食醋的营养，是集保健、食疗等功能为一体的新型饮品[4]。饮用果醋对人体健康有一定好处，如果能利用多种果蔬，将其制成复合型果醋，可以使果醋的营养种类更为丰富，复合型果醋也将拥有更广阔的市场前景[5]。本试验以葡萄和枸杞为原料，采用液态发酵法酿制复合果醋，探讨葡萄枸杞复合果醋适宜的发酵工艺，以期为葡萄枸杞复合果醋的开发提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠葡萄：产于甘肃张掖；7号红枸杞干果：产于甘肃白银；白砂糖（食品级）：市售。活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸杆菌：济宁玉园生物科技有限公司。

葡萄糖（分析纯）：天津市盛奥化学试剂有限公司；体积分数95%的乙醇（分析纯）：上海中秦化学试剂有限公司；琼脂：天津市致远化学试剂有限公司；酵母膏：北京奥博星生物技术有限责任公司；果胶酶（1.2×105U/g）：烟台帝伯仕自酿机有限公司。

1.2 仪器与设备

TQHZ-2002A大容量全温度振荡培养箱：太仓华美生化仪器厂；DHP-9272电热恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；BSA224S电子天平：北京赛多利斯科学仪器有限公司；DHG-9246A电热恒温鼓风干燥箱：上海玺袁科学仪器有限公司；pH 510型精密pH计：上海安莱立思仪器科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合果醋酿造工艺流程及操作要点[6]

原料选择：葡萄和枸杞应选择成熟、无病和无霉烂的果实。

葡萄汁的制备[7]：葡萄去梗后，破碎，并立即添加140mg/L H2SO3（以SO2计）防止氧化，同时加入30 mg/L果胶酶，并于低温条件下浸渍48 h，备用。

枸杞汁的制备[8]：枸杞清洗，40～50℃水浸泡20～30 min，以1∶3（g∶mL）的比例加水破碎打浆、过滤，并在枸杞汁中加入30 mg/L果胶酶与70 mg/L H2SO3（以SO2计）混匀，低温条件下浸渍48 h，备用。

调整糖度、pH值：葡萄汁和枸杞汁按1∶1（mL∶mL）混合后，使用白砂糖调节糖度为18°Bx，且在发酵刚刚开始的时候一次性加完[9]。之后用pH计测定果浆的初始pH值，加入适量的碳酸钙或酒石酸进行降酸或增酸，以便达到预定pH值。

酵母的活化[10]：取一定量的活性干酵母，加入其质量5%的白砂糖以及20倍质量的水，搅拌均匀，置于35～40℃电热恒温水浴锅中30 min，冷却至28～30℃备用。

酒精发酵：将活化好的酵母（温差不超过10℃）加入待发酵液中进行酒精发酵，发酵6～7 d，发酵期间定期测定酒精度、相对密度、温度、可溶性固形物，当相对密度达到0.992～0.996时，终止酒精发酵，转入醋酸发酵。

醋酸菌的活化[11]：保藏菌种先经斜面活化，32℃培养24 h后，转入醋酸菌活化培养基中，4层纱布封口，32℃、120 r/min振荡进行活化，24 h后得到醋酸菌种子液。

醋酸发酵：将醋酸菌种子液以一定的接种量接种于发酵液中进行醋酸发酵，放入恒温振荡培养箱中，在一定的温度条件下培养一定的时间，定期测定酸度，至酸度不再上升时结束发酵，经过滤、澄清并于75℃灭菌20 min[12]得到成品复合果醋。

1.3.2 酒精发酵单因素试验设计

分别选取初始pH值（3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）、发酵温度（22℃、24℃、26℃、28℃、30℃）、酵母添加量（2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%）3个因素进行酒精发酵单因素试验，以酒精度为考察指标。

在单因素试验的基础上设计L9（33）正交试验，以初始pH值（A）、发酵温度（B）、酵母添加量（C）为3个因素，以酒精度为考察指标，优化酒精发酵条件，正交试验因素水平见表1。

表1 酒精发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for alcoholic fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸发酵单因素试验设计

选择发酵温度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、发酵时间（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、醋酸菌接种量（2%、4%、6%、8%、10%）3个因素进行醋酸发酵单因素试验，以总酸（以醋酸计）含量为考察指标。

在单因素水平试验的基础上设计L9（33）正交试验，以发酵温度（E）、发酵时间（F）、接种量（G）为3个因素，以总酸含量为考察指标，优化醋酸发酵工艺条件，正交试验因素水平见表2。

表2 醋酸发酵条件优化正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.4 测定方法

（1）感官指标测定

复合果醋的感官指标参照GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》规定的感官方法进行分析。

表3 复合果醋感官评价标准Table 3 Sensory evaluation standards of compound fruit vinegar

（2）理化及微生物指标测定

可溶性固形物：采用手持糖量计测定[13]；酒精度：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》执行，采用密度瓶法测定；总糖与还原糖：采用菲林试剂滴定法测定[14]；总SO2：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》执行，采用直接碘量法测定；总酸：按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中电位滴定法测定；菌落总数及大肠菌群：参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。

2 结果与分析

2.1 酒精发酵试验

2.1.1 初始pH值对酒精发酵的影响

图1 初始pH值对酒精发酵的影响Fig.1 Effect of initial p H value on alcoholic fermentation

初始pH值低于3.8时，酒精度随初始pH的升高而逐渐上升，pH过低，不利于酵母菌的活动，酵母生长缓慢，产酒精量较少，此时提高pH值，可以提高酒精发酵产物的量；初始pH为3.8时，酒精度达到最大，为8.25%vol；初始pH值继续增大，酒精度下降，是由于酸度过低，抑制酵母菌的生长繁殖，不利于酒精发酵，造成发酵不彻底，产酒精率下降，甚至会使发酵失败。因此，选择酒精发酵的最佳初始pH值为3.8。

2.1.2 发酵温度对酒精发酵影响高而逐渐升高，是因为酵母菌生长对温度敏感，升高温度能加快酵母菌生长繁殖[16]；发酵温度为28℃时，酒精度达到最高，为8.19%vol，继续升高发酵温度，会导致酒精度下降，是由于高温对酵母菌生长不利，使酵母提前出现疲劳状态而抑制酒精发酵，发酵提前终止，酒精度较低[17]。因此，选择酒精发酵最适温度为28℃。

2.1.3 酵母添加量对酒精发酵的影响

由图3可知，酵母添加量为2.0%～6.0%时，酒精度随酵母添加量增加而逐渐升高；酵母添加量为6.0%时，酒精度达到最高，为8.15%vol；继续增大酵母添加量酒精度反而降低，可能是由于在酒精发酵前期，酵母过多，会产生大量的酒精，导致酵母菌生长受到抑制，酒精度增加缓慢，产酒精量相对较低[15]。因此，选择酒精发酵最适酵母添加量为6.0%。

图3 酵母添加量对酒精发酵的影响Fig.3 Effect of yeast addition on alcoholic fermentation

2.2 酒精发酵工艺优化

酒精发酵工艺优化正交试验结果见表4，方差分析结果见表5。

表4 酒精发酵条件优化正交试验结果与分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments for alcoholic fermentation conditions optimization

图2 发酵温度对酒精发酵的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on alcoholic fermentation

由图2可知，发酵温度为22～28℃时，酒精度随温度升

表5 酒精发酵条件优化正交试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results for alcoholic fermentation conditions optimization

从表4、表5可知，3个因素的主次关系依次为初始pH值、发酵温度、酵母添加量。显著性检验表明，初始pH值对酒精发酵的影响为极显著水平（P＜0.01）；温度对酒精发酵为显著水平（P＜0.05）；酵母添加量对酒精发酵影响不显著（P＞0.05）。最优的工艺组合为A3B2C2，即初始pH值为4.0，发酵温度为28℃，酵母添加量为6%。在此条件下进行验证试验，测得发酵液中酒精度为8.28%vol，表明优化的工艺条件稳定。

2.3 醋酸发酵单因素试验

2.3.1 发酵温度对醋酸发酵的影响

图4 发酵温度对醋酸发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

由图4可知，在一定温度范围内，醋酸菌的生长繁殖随发酵温度的升高而增加，果醋中总酸含量随发酵温度升高而逐渐上升，当发酵温度为30℃时，总酸含量达到最大，为3.30 g/100 mL；当发酵温度升高到一定程度，菌体容易老化，醋酸菌的生长代谢受到阻碍，醋酸含量下降[18]。因此，选择30℃为醋酸发酵的最适发酵温度。

2.3.2 发酵时间对醋酸发酵的影响

在一定时间范围内，发酵液中酸含量随发酵时间的延长而逐渐上升，发酵时间为5 d时，发酵液中总酸含量达到最大，为3.52 g/100 mL；发酵时间继续延长，总酸含量几乎保持不变，是由于醋酸菌在繁殖初期数量少，随时间延长醋酸菌大量繁殖，乙酸含量上升，发酵后期，由于产物抑制作用导致酸含量不再增加，发酵液中酸含量几乎保持不变[19]。因此，选择醋酸发酵最适时间为5 d。

图5 发酵时间对醋酸发酵的影响Fig.5 Effect of fermentation time on acetic acid fermentation

2.3.3 接种量对醋酸发酵的影响

随着接种量增大，果醋中总酸含量上升，接种量过低，醋酸菌浓度低，产酸速率慢，提高接种量可使产酸速度加快[20]；接种量为4%时，总酸含量达到最大，为3.70 g/100 mL；继续增加接种量，由于醋酸菌含量过高，导致发酵后期营养物质不足，影响醋酸菌生长发酵能力，不利于醋酸的积累，产酸速度减缓。因此，选择醋酸菌最适接种量为4%。

图6 接种量对醋酸发酵的影响Fig.6 Effect of inoculum on acetic acid fermentation

2.4 醋酸发酵工艺优化

醋酸发酵工艺优化正交试验结果见表5。

表5 醋酸发酵条件优化正交试验结果与分析Table 5 Results and analysis of orthogonal experiments for acetic acid fermentation conditions optimization

续表

由表5可知，在试验号为1、4、5、8的工艺条件下发酵的果醋，总酸含量均低于3.5 g/100 mL，不符合果醋酿造的国家标准。

从极差分析中可以看出，在醋酸发酵阶段3个影响因素的主次顺序为发酵时间＞发酵温度＞接种量。可见，在醋酸发酵工艺中，对这3个因素而言，发酵时间最为重要，其次是发酵温度，接种量对产酸量影响不显著。最优的工艺组合为E3F3G2，即发酵温度为32℃，发酵时间为6 d，醋酸菌接种量为4%。在此条件下进行验证试验，测得复合果醋中总酸含量为4.27 g/100 mL。

2.5 产品质量指标

2.5.1 感官指标结果

色泽：红茶色，有光泽；香气：有枸杞特有的果香味、醋香；葡萄水果的混合香味，香味浓郁协调；滋味：口感柔和甘爽，酸甜适中，无涩味，无不良气味；体态：体态澄清透明，无沉淀和悬浮物。

2.5.2 理化指标

总酸（以醋酸计）：4.27 g/100 mL；还原糖（以葡萄糖计）2.5 g/L；SO2：125 mg/L。以上指标均符合国家标准。

2.5.3 微生物指标

菌落总数≤50 CFU/mL；大肠菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌：未检出。

3 结论

以葡萄和枸杞为原料，通过酒精发酵和醋酸发酵两个阶段的试验，研究复合果醋的最佳生产工艺，结果表明，酒精发酵的最佳工艺条件为酵母添加量6.0%、初始pH值为4.0、发酵温度为28℃，发酵时间6 d；醋酸发酵的最佳工艺条件为醋酸菌接种量4.0%，发酵温度32℃，发酵时间6d。此条件下制得的葡萄枸杞复合果醋呈红茶色，有光泽；有葡萄、枸杞特有的果香味、醋香，葡萄水果的混合香味，香味浓郁协调；口感柔和甘爽，酸甜适中，无涩味，无不良气味；体态澄清透明，无沉淀和悬浮物。总酸（以醋酸计）为4.27 g/100 mL，还原糖（以葡萄糖计）为2.5 g/L，工艺条件稳定。