HS-SPME-GC-MS分析玫瑰香葡萄中挥发性物质的萃取条件优化

岳 圆，刘 晶，张存智*

（1.宁夏职业技术学院 生物与制药技术系，宁夏 银川 750001；2.宁夏农业学校，宁夏 银川 750001）

葡萄酒是破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或葡萄汁经完全或部分酒精发酵后获得的饮料。香气物质是构成葡萄酒质量的主要因素之一，其主要来源有葡萄品种本身、生化反应、微生物代谢、葡萄酒贮存期间的化学或酶反应等[1-3]。葡萄酒中所含香气成分的种类、含量、感官阈值是评判葡萄酒品质的重要指标，决定了葡萄酒的风味和典型性[4-5]。玫瑰香葡萄是鲜食和酿酒兼用品种，玫瑰香葡萄又名麝香葡萄，是原产英国的欧亚种葡萄[6]。玫瑰香作为鲜食、酿酒、制汁的兼用品种，在我国栽培面积较广[7]，因其具有特殊的玫瑰香味深受消费者喜爱。葡萄酒的挥发性物质很大部分来自于葡萄果实[8]，所以研究葡萄果实香气的意义十分深远。

葡萄果实的挥发性物质可以通过仪器提取出来，目前顶空固相微萃取法（head space solid phase microextraction，SPME）是普遍使用的技术手段之一，这种技术快速并且价格低廉，不需要使用溶剂，可以检测出超低浓度的物质，而且不需要太多的样品量[9]。利用SPME技术，结合气相色谱-质谱检测，可以同时分析几千种挥发性化合物，但在检测过程中，检测条件必须优化[10]。在萃取过程中，萃取量、萃取头类型、萃取温度、萃取时间、加入的电解质和pH值、试样混合速率等都是影响萃取效果的重要因素[11-12]。有关玫瑰香葡萄果实香气顶空固相微萃取条件的优化鲜见相关报道，萃取过程中在平衡、吸附、解吸环节所用时间的长短研究也较少。

本研究采用不同的平衡时间、解吸时间、萃取温度、吸附时间对玫瑰香果实的挥发性物质进行顶空固相微萃取（SPME），经过气质联用（gas chromatography-mass spectroscopy，GC-MS）法检测，通过比较不同萃取条件下玫瑰香果实挥发性物质的萃取差异，确定最适宜的萃取条件，为玫瑰香葡萄果实的检测以及进一步分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选自宁夏贺兰山东麓玉泉营6年生玫瑰香葡萄。2016年达到商品成熟期时进行采摘，采摘当天运回实验室预冷并贮藏于0℃冷库中。实验所用试剂（均为分析纯）：上海源叶生物科技有限公司。蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 仪器与设备

QP2010型GC-MS联用仪、HP-5色谱柱（30.0m×0.25mm，0.25 μm）：美国Agilent公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市子华仪器有限公司；顶空进样瓶20 mL：石家庄大晋科技有限公司；50/30 μm聚二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取头（纤维头）：美国Supelco公司；MOF-4086S低温冰箱：日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将保存的样品用液氮研磨至粉末状，准确称取3 g放入20 mL顶空进样瓶中，再量取5 mL饱和氯化钠溶液，放入磁力转子后，立即用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）/硅橡胶隔垫将样品瓶密封压紧[13]，将萃取头插入萃取瓶，置于恒温加热磁力搅拌器中，平衡一定时间并在萃取温度条件下吸附一定时间，样品萃取平衡后，选择一定解吸时间进行气相色谱-质谱分析。

1.3.2 GC-MS操作条件

GC条件：毛细管色谱柱DB-1（30m×0.25mm×0.25μm），升温程序：初始温度40℃，保持3min，以5℃/min的速率上升至160℃，保持2min，再以8℃/min上升至220℃，保留5min，载气为氦气，流速为1 mL/min，进样方式为不分流进样。

MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，离子源温度为200℃，扫描范围：40～350 amu，采用选择离子监测（selected ion monitoring，SIM）模式条件下对样品进行分析，根据定性离子和保留时间对物质进行定性[14]。

1.3.3 SPME技术参数优化设计[15]

以平衡时间、解吸时间、萃取温度及吸附时间为单因素设计优化实验。平衡时间设定为5 min、10 min、15 min，解吸时间设定为4min、5min、6min，萃取温度设定为20℃、30℃、40℃，吸附时间设定为30 min、40 min、50 min，分别研究以上各因素对萃取结果的影响。

1.3.4 定性与定量分析

玫瑰香葡萄果实香气成分分析采用GC-MS联用仪[16]。数据分析运用计算机检索并与图谱库的标准质谱图对照，结合有关文献，确认香气物质的化学成分，将相似性低于70%的物质去掉，按峰面积归一化法算出样品各个组分的相对含量。挥发性物质相对含量的计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 平衡时间的选择

图1 3种平衡时间条件下玫瑰香葡萄挥发性物质萃取数量（A）和相对含量（B）的比较Fig.1 Comparison of the extraction number(A)and relative content(B)of volatile compounds from Muscat under three kinds of equilibrium time conditions

由图1可知，当平衡时间为5 min时，共鉴定出40种化合物，其中醇类11种，醛类4种，酸类2种，酯类3种，醚类3种，酮类2种，碳氢化合物13种，其他物质2种，相对含量（分别占总挥发性物质含量）分别为67.59%、1.95%、18.69%、3.52%、1.40%、1.69%、2.02%和0.25%。当平衡时间为10 min时，共鉴定出39种化合物，其中醇类7种，醛类4种，酸类1种，酯类8种，醚类3种，酮类3种，碳氢化合物12种，其他物质1种，相对含量分别为43.88%、1.07%、16.16%、18.39%、2.73%、2.07%、4.43%和6.68%。当平衡时间为15 min时，共鉴定出41种化合物，其中醇类10种，醛类3种，酯类7种，醚类4种，酮类5种，碳氢化合物11种，其他物质1种，相对含量分别为51.05%、1.12%、20.32%、13.78%、1.22%、0.83%、2.20%和1.93%。三种平衡时间下醇类化合物萃取的相对含量有显著差异，平衡时间5 min时最高（67.59%），平衡时间10 min时最低（43.88%）。平衡时间15 min时醇类数量最低，其他两组醇类物质数量无明显差异；各种处理方法萃取的碳氢化合物的数量均较高，而相对含量均较低；各种处理方法萃取的酯类物质种类和相对含量有显著差异，平衡时间15 min条件下萃取的酯类物质数量最多，其次是平衡时间10 min的结果，说明平衡时间越长，萃取的酯类物质数量越多。而酯类相对含量则是平衡时间10 min时最高。酸类物质种类在平衡时间5min时较其他两组高。不同平衡时间下萃取的醛类、醚类、酮类物质、碳氢化合物相对含量无显著性差异，但平衡时间10 min时，醛类、醚类、酮类物质种类较其他两组的多。为获得较全面的物质信息、主要呈香物质的相对含量比，选用平衡时间10 min进行萃取较为适宜。

2.2 解吸时间的选择

图2 3种解吸时间条件下玫瑰香葡萄挥发性物质数量比较Fig.2 Comparison of the number of volatile compounds from Muscat under three desorption time conditions

由图2可知，当解吸时间为4 min时，共检测出31种化合物，其中醇类5种，酸类1种，酯类7种，醚类2种，酮类3种，碳氢化合物8种，其他物质5种。当解吸时间为5 min时，共检测出36种化合物，其中醇类4种，醛类3种，酸类2种，酯类4种，醚类5种，酮类2种，碳氢化合物10种，其他物质6种。当解吸时间为6 min时，共检测出26种化合物，其中醇类3种，醛类1种，酸类1种，酯类4种，醚类3种，酮类1种，碳氢化合物9种，其他物质4种。解吸时间为5 min时，醛类、酸类、醚类、酮类、碳氢化合物的数量均较高，醇类物质数量在解吸时间4 min时最多，6 min时最少，说明解吸时间越长，醇类数量就越少，而酯类物质数量是在解吸时间6 min时最多。由表1可知，在不同解吸时间条件下，各挥发性物质差异显著，其中芳樟醇、橙花醚、玫瑰醚、香叶醇等均在不同处理方法中被检测出来，解吸时间5 min时峰面积显著大于其他两组。辛酸乙酯在解吸时间5 min时峰面积显著大于解吸时间6 min时，而在解吸时间4 min时并未检测到。橙花醇的峰面积在解吸时间5 min时显著大于解吸时间4 min时，解吸时间6 min时并未检测到。解吸时间5 min时，检测到葵醛、柠檬醛、环丙烯、缩水甘油、丙二烯、巴豆酸乙烯酯，而在其他处理方法中并未检测到。考虑到检测出来的挥发性物质的数量以及峰面积的大小，选择解吸时间5 min萃取较好。

表1 3种解吸时间条件下玫瑰香葡萄主要挥发性物质峰面积比较Table 1 Comparison of peak area of main volatile compounds from Muscat under three desorption time conditions

2.3 萃取温度的选择

图3 不同萃取温度条件下玫瑰香葡萄挥发性物质数量以及峰面积比较Fig.3 Comparison of the number and peak area of volatile compounds from Muscat under different extraction temperature conditions

由图3可知，萃取温度为20℃时，共检测出34种化合物，其中醇类6种，醛类3种，酸类1种，酯类4种，醚类4种，碳氢化合物10种，其他物质6种；萃取温度为30℃时，共检测出44种化合物，其中醇类6种，醛类3种，酸类1种，酯类9种，醚类3种，酮类3种，碳氢化合物11种，其他物质8种；萃取温度为40℃时，共检测出42种化合物，其中醇类2种，醛类3种，酸类1种，酯类18种，醚类2种，酮类2种，碳氢化合物8种，其他物质6种。萃取温度为40℃时，酯类物质数量明显增加，但其他类化合物数量较低，萃取温度为30℃时，除酯类物质，其他各类挥发性物质种类较多。在20℃、30℃和40℃三种萃取温度下，各类挥发性物质峰面积差异也较为明显，萃取温度40℃条件下醇类物质峰面积显著低于其他两种处理方法，其他两组无显著差异；醛类、醚类、酮类物质和碳氢类化合物峰面积均较低。30℃处理中的酸类物质峰面积显著高于其他两组处理方法，不同温度下萃取的酯类物质峰面积差异显著，其中40℃时最大，20℃时最小。由以上可以得出，考虑到检测到的挥发性物质的数量和主要挥发性物质的响应强度，选择萃取温度30℃较好。

2.4 吸附时间的选择

图4 不同吸附时间条件下玫瑰香葡萄挥发性物质数量比较Fig.4 Comparison of the number of volatile compounds from Muscat under different adsorption time conditions

由图4可知，不同吸附时间条件下，醛类、酮类和碳氢化合物在数量上无明显差异，酯类物质有明显差异，吸附40 min时数量最多，吸附30 min时数量最少。吸附50 min条件下萃取的醇类物质数量较其他两种处理方法的多，吸附30 min时醇类数量较少。酸类、醚类在吸附50 min时较其他两种处理方法的少。由表2可以看出，玫瑰醚、橙花醚、葵醛、香叶醇、肉豆蔻酸异丙酯的峰面积有显著差异（P＜0.05），吸附40 min条件下各物质的响应强度最高；芳樟醇、辛酸乙酯在吸附50 min条件下峰面积最大，酞酸二甲酯则在吸附30 min条件下峰面积最大。薄荷脑、香叶酸只在吸附时间30 min时被检测到；壬酸、大根香叶烯、水杨酸-2-乙基己基酯只在吸附40 min条件下检测出来，其他处理方法并未检测到，柏木脑、左旋乙酸冰片酯只在吸附50 min时被检测到。综合以上因素，考虑到各物质的种类数量和主要挥发性物质的响应强度，吸附40 min条件下各挥发性化合物数量均较高，且响应强度较高，故选择吸附40 min较为合适。

表2 3种吸附时间条件下玫瑰香葡萄主要挥发性物质峰面积比较Table 2 Comparison of peak area of main volatile compounds from Muscat under three kinds of adsorption time conditions

2.5 最优萃取条件下的香气成分

在最佳萃取条件下，经GC-MS分析，共检出70种化合物，经与标准谱图比对以及去除杂质物质5种，共鉴定出39种主要挥发性化合物，匹配度均＞70%，说明采用顶空固相微萃取方法能够定性分析玫瑰香葡萄香气的主要成分，结果见表3。由表3可知，39种化合物峰面积之和占总峰面积的96.54%，说明此种方法可快速、准确地定量玫瑰香葡萄的主要香气成分。

研究发现，萃取温度过高，会造成萃取出来的酯类物质含量偏高，而其他物质含量偏低，可能是由于温度较高，使得挥发性物质发生氧化，如醇类、醛类、酮类等物质被氧化而形成酯类物质。萃取温度过低，使得挥发性物质不能很好地萃取出来，造成挥发性物质含量偏低，数量偏少。在平衡和解吸的过程中，如果时间过长，则萃取出来的酯类物质较多，而其他种类的挥发性物质较少，可能是由于过长的时间使得一些挥发性物质经氧化形成酯类物质；时间过短，则萃取出来的物质种类较少，响应强度也较低。在吸附的过程中，随着相对分子质量的增大，化学物质的萃取平衡较难达到，延长吸附时间，有利于达到萃取平衡。相对分子质量较小的挥发性物质平衡容易达到，但吸附时间过长，因竞争吸附会造成小分子物质的脱附[18]。

表3 玫瑰香葡萄香气成分GC-MS分析结果Table 3 GC-MS analysis results of aroma compounds from Muscat

葡萄果实的风味主要由成香（香气物质）和成味物质决定（糖、酸）[19]。本研究检测出玫瑰香葡萄中醇类物质和酯类物质是主要的香气物质，其中芳樟醇的响应强度最高，达到108；其次为香叶醇、酞酸二甲酯，响应强度达到107；橙花醇、辛酸乙酯、葵酸乙酯、香叶醇、玫瑰醚等物质的响应强度为106，这些物质中，橙花醇，有温和的甜香气味，辛酸乙酯，有玫瑰、橙子的花果香[13]，葵酸乙酯具有椰子香型香气，香叶醇具有温和、香甜的玫瑰花气息，玫瑰醚，有清甜的花香香气，似玫瑰和新鲜香叶的香韵，香气偏甜细腻[20]，这些物质均能表现出玫瑰香果实特有的香气。刘波[21]等研究表明，利用GC-MS技术进行分析，主要成分为3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇（沉香醇）和2-己烯醛，其相对含量分别为21.043%和10.400%，本研究与该报道有相似之处，也检测出有沉香醇物质，在最佳萃取条件下相对含量为22.11%，不同之处在于本研究检测出芳樟醇、香叶酸为主要物质，相对含量分别达到35.24%、18.67%。刘万好等[22]研究表明，玫瑰香果实在萃取温度为60℃时吸附45 min，可萃取24种挥发性化合物，能检出玫瑰香葡萄中含有里那醇、2-己烯醛、β-月桂烯、蒎烯、紫苏烯、苯乙醇、异戊醇等物质，而本研究并未检测到，可能是由于玫瑰香葡萄的产地不同，因而香气成分略有差异。但本研究萃取的化合物数量较多，萃取条件更优。

3 结论

本研究比较了平衡时间、解吸时间、萃取温度、吸附时间四个因素对玫瑰香葡萄检出的挥发性物质数量和各类挥发物的峰面积的影响，最优组合为平衡时间10 min，解吸时间5 min，萃取温度为30℃，吸附时间40 min。在此优化萃取条件下，得到的挥发性物质的数量和响应强度较高，检测出玫瑰香果实的主要挥发性物质有芳樟醇、橙花醚、玫瑰醚、橙花醇、香叶醇、辛酸乙酯、柠檬醛、酞酸二甲酯、棕榈酸甲酯、正辛基醚等。本研究建立的GC-MS分析方法可以获得较全面的玫瑰香葡萄中挥发性物质的组成信息。