产愈创木酚类细菌的培养条件优化

周金虎，叶 凯，李 良，董孝元，李 梦，方尚玲，陈茂彬*

（1.发酵工程教育部重点实验室（湖北工业大学），湖北 武汉 430068；2.工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068；3.工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068；4.黄鹤楼酒业（咸宁）有限公司，湖北 咸宁 437000；5.武汉雅仕博科技有限公司，湖北 武汉 430068）

愈创木酚类物质是一类广泛存在于酱香、浓香、兼香和芝麻香型白酒中的天然呈香化合物，对白酒香气具有重要的贡献[1]。研究表明，愈创木酚类物质是自由基清除剂，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和预防心血管等多种疾病的发生，具有预防疾病、抗衰老、促进人体健康的作用[2-3]。

国内外的相关研究表明，产愈创木酚类物质的的菌主要是一些芽孢杆菌和圆酵母。王霜等[4]从兼香型白酒酒醅中筛选到2株高产4-乙烯基愈创木酚的菌株，地衣芽孢杆菌LS9和枯草芽孢杆菌S10。王少磊等[1]从浓香型大曲中筛选到一株高产4-乙基愈创木酚的菌株EG06，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

本试验以从某浓香型酒厂窖泥中筛选到的高产愈创木酚的戴尔福特菌（Delftia sp.）为基础，对细菌产愈创木酚类物质的培养条件进行了优化，以期为生产实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高产愈创木酚类物质的细菌为戴尔福特菌（Delftia sp.）：本实验室从某酒厂窖泥中筛选。

种子培养基（营养肉汤培养基）[5]：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L，加10%NaOH溶液调整pH为7.2～7.4，121℃灭菌20 min。

麸曲培养基[6]：麸皮100 g、水80 mL，水中加少量NaOH调整pH为7.2～7.4，121℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

5977B-7890B气相色谱质谱联用仪（gaschromatographymass spectrometer，GC-MS）：美国安捷伦公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；LRH-250生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

无菌条件下，挑取一环戴尔福特菌（Delftia sp.）接种于种子培养基中，37℃、180 r/min培养24 h。

1.3.2 单因素试验设计[7-9]

麸曲培养基水分的确定：麸皮100 g，分别按50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL添加水，NaOH调整pH值为7.2～7.4，装入500 mL三角瓶中，接入10%种子液，37℃培养48h。培养好的麸曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麸曲，加入饱和NaCl溶液1 mL，测定愈创木酚类物质含量。

培养时间的确定：麸曲培养基中接入10%种子液，于37 ℃分别培养24 h、30 h、36 h、48 h、60 h。培养好的麸曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麸曲，加入饱和NaCl溶液1mL，测定愈创木酚类物质含量。

接种量的确定：麸曲培养基中分别接入5%、7%、9%、11%、13%的种子液，37℃培养48 h。培养好的麸曲于35℃烘干48 h后粉碎，取0.5 g麸曲，加入饱和NaCl溶液1 mL，测定愈创木酚类物质含量。

培养温度的确定：麸曲培养基中接入10%种子液，分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃培养48 h。培养好的麸曲于35℃烘干48h后粉碎，取0.5g麸曲，加入饱和NaCl溶液1mL，测定愈创木酚类物质含量。

1.3.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以麸曲培养基水分（A）、培养时间（B）、接种量（C）、培养温度（D）为考察因子，以愈创木酚类物质含量（Y）为响应值，利用Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken Design进行响应面试验设计，因素与水平编码值见表1。

表1 细菌培养条件优化Box-Behnken试验因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for bacteria culture conditions optimization

1.3.4 测定方法

愈创木酚类物质含量采用GC-MS法进行测定，采用外标法进行定量检测[13]。

样品处理：取样品0.5 g，加入饱和NaCl溶液1 mL，顶空固相微萃取20 min。气相色谱条件：DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。进样口温度260℃，载气为氦气（He），流速1.0mL/min，不分流进样。升温程序为50℃，保持0min，再以20℃/min的速度升温至150℃，保持0min，再以10℃/min的速率升温至220℃，保持5 min。溶剂延迟：5 min[13]。

质谱条件：电子电离源（electron ionization，EI），采集类型：选择离子监测（selected ion monitor，SIM）模式扫描。电子能量70 eV，离子源温度230℃，MS四级杆温度150℃，质量扫描范围50.00～600.00 m/z。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 麸曲培养基水分对愈创木酚类物质含量的影响

图1 麸曲培养基水分对愈创木酚类物质含量的影响Fig.1 Effect of moisture of bran medium on guaiacols content

由图1可知，随着麸曲培养基中水分的增加，愈创木酚类物质含量呈现出先增加后降低的趋势，水分为80%时愈创木酚类物质含量最高，为3.476×10-4g/g；水分过低将降低营养物质传输、微生物生长、酶稳定性和基质膨胀，水分过高将导致颗粒结块、通气不畅和染菌，从而导致愈创木酚类物质含量下降，因此选择麸曲培养基的水分为80%。

2.1.2 培养时间对愈创木酚类物质含量的影响

图2 培养时间对愈创木酚类物质含量的影响Fig.2 Effect of culture time on guaiacols content

由图2可知，随着培养时间的延长，愈创木酚类物质的含量呈现先增加后降低的趋势，培养时间为48 h时愈创木酚类物质含量最高，为3.521×10-4g/g。微生物的生长具有最适的生长周期，培养时间过短，微生物的对数生长期不能达到，菌的总体数量不多，没有到达产酶的最佳时期，如果培养时间过长，菌种过度生长而衰老，同时在生长后期会产生一些有害代谢产物，不利于菌种的生长和代谢[10]。因此选择培养时间为48 h。

2.1.3 接种量对愈创木酚类物质含量的影响

图3 接种量对愈创木酚类物质含量的影响Fig.3 Effect of inoculum on guaiacols content

由图3可知，随着接种量的增加，愈创木酚类物质含量呈现先增加后降低的趋势，当接种量为9%时愈创木酚类物质含量最高，为3.586×10-4g/g。分析原因可能是，适宜的接种量可以使菌株延滞期缩短，提前进入对数生活期，快速产酶提高愈创木酚类物质产量，当接种量＞9%时，愈创木酚类物质含量下降，原因可能是由于代谢产物的带入，对菌株的生长起到抑制作用[11]。因此选择接种量为9%。

2.1.4 培养温度对愈创木酚类物质含量的影响

图4 培养温度对愈创木酚类物质含量的影响Fig.4 Effect of culture temperature on guaiacols content

由图4可知，随着培养温度的升高，愈创木酚类物质含量呈现先增加后降低的趋势，当培养温度为37℃时愈创木酚类物质含量最高，为3.589×10-4g/g。分析原因可能是培养温度过低，菌种生长的相对缓慢，到达对数生长期的时间会往后延长，因此产酶和愈创木酚类物质的含量会相对较低，而培养温度过高，菌株生长较快，快速到达对数生长期，产酶和愈创木酚类物质含量较多，同时也会逐渐产生有害代谢产物，对菌株的生长起到抑制作用[12]。因此选择培养温度为37℃。

2.2 Box-Behnken试验

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果

由单因素试验结果可知，不同试验因素对愈创木酚类物质含量的影响有所不同。为了优化细菌麸曲中愈创木酚类物质含量的最佳条件，以中心组合试验设计原理为依据，根据单因素试验结果分析，进行4因素3水平响应面设计分析，共设计29次试验，24次为析因试验，5次中心试验，响应面试验设计及结果见表2，回归模型方差分析结果见表3。

表2 细菌培养条件优化Box-Behnken试验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for bacterium culture conditions optimization

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6软件对表3的数据进行多元回归拟合分析，得出响应面回归方程如下：Y=3.65+0.16A+0.18B+0.20C+0.42D+0.18AB-0.27AC+0.68AD-9.750E-003BC+0.047BD+0.18CD-0.62A2-0.41B2-0.065C2-0.64D2。

由表3可知，根据F值各个因素对试验结果影响次序为D＞C＞B＞A，即培养温度＞接种量＞培养时间＞水分。建立的模型P＜0.0001，模型极显著。失拟项P=0.5041＞0.05，表示纯误差不显著。其中一次项B、C、D，交互项AD，二次项A2、B2、D2均呈极显著（P＜0.01），交互项AC显著（P＜0.05），说明相关因素对细菌麸曲中愈创木酚类物质的含量影响较大。决定系数R2=0.953 5，表明细菌麸曲中愈创木酚类物质含量实际值与预测值拟合度。校正决定相关系数R2Adj=0.907 0，表明该该模型中各因素对愈创木酚类物质含量变化情况。综上所述，此模型有效，可以来预测分析各因素对愈创木酚类物质含量的影响。

2.2.2 响应面分析与优化

根据回归方程绘制响应面分析图，以确定水分、培养时间、接种量、培养温度对愈创木酚类物质含量的影响，响应曲面和等高线见图5。

图5 水分、培养时间、接种量与培养温度交互作用对愈创木酚类物质含量影响的响应面与等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between moisture,fermentation time,inoculum and fermentation temperature on guaiacol contents

由图5可知，水分含量与培养时间交互作用、水分含量与接种量交互作用、水分含量与培养温度交互作用、培养时间与接种量交互作用、培养时间与培养温度交互作用、培养温度与接种量交互作用的显著性情况与表3中交互项P值的分析结果一致。响应面的坡度较为陡峭，表明愈创木酚类的产量对水分与培养时间、水分与接种量、水分与培养温度、培养时间与接种量、培养时间与培养温度、培养温度与接种量的变化较为敏感[14]。在水分不变的条件下，随着培养时间的延长，愈创木酚类物质含量呈先上升后下降的变化趋势；在培养时间不变的条件下，随着水分的逐渐增加，愈创木酚类物质含量呈先上升后下降的趋势，且变化较大，其他交互因素同上[15]。

等高线呈圆形，表明2个因素之间的交互作用强度较弱，影响不显著。等高线呈椭圆形，表明2个因素之间的交互作用强度较强，影响显著。

通过Design Expert（v8.0.6）软件分析，产愈创木酚的最佳条件为麸曲培养基水分81.56%、培养时间49.848 h、接种量11.0%、培养温度38.288℃，此条件下愈创木酚类物质含量的理论值为3.986×10-4g/g。

2.2.3 验证试验

考虑到实际操作的方便性，将本试验所得最佳条件修改为麸曲培养基水分81.5%、培养时间50 h、接种量11.0%、培养温度38℃，进行3次平行试验，实际测得的平均愈创木酚类物质含量为3.893×10-4g/g，试验值与理论值相近，证明应用响应面法优化细菌麸曲产愈创木酚类的培养条件是可行的。

3 结论

近年来，白酒中健康因子的研究成为越来越多科研工作者研究的热点。研究表明，愈创木酚类物质是良好的自由基清除剂，具有良好的活性氧消除功能，可抗氧和预防心血管等多种疾病的发生，具有预防疾病、抗衰老、促进人体健康的作用。试验通过单因素试验分析了麸曲培养基水分含量、培养时间、接种量和培养温度对愈创木酚类物质含量的影响，并结合Box-Behnken设计及响应面分析，建立了二次多项式模型，并经显著性检验证明了该模型具有可靠性。所得最佳培养条件为麸曲培养基水分81.5%、培养时间50 h、接种量11.0%、培养温度38℃，在此条件下，愈创木酚类物质含量为3.893×10-4g/g。通过优化细菌麸曲制作工艺，探索各条件对麸曲制作的影响，为细菌麸曲应用于白酒酿造行业提供一定的数据参考。