埃博拉疫苗临床试验研究进展

2018-11-02侯利华

传染病信息 2018年5期

张哲，侯利华

1 埃博拉病毒

埃博拉病毒属于丝状病毒科，为单股负链RNA病毒，病毒颗粒直径约80 nm，外有包膜。埃博拉病毒是引发埃博拉病毒病（Ebola virus disease, EVD）的主要病原体，主要分为扎伊尔型（Zaire）、苏丹型（Sudan）、本迪布焦型（Bundibugyo）、塔伊森林型（Tay forest）和莱斯顿型（Reston）5种亚型[1]。该病毒在感染后会有3～21 d的初始潜伏期，随后迅速出现发烧、头痛、肌肉酸痛、腹泻、呕吐等症状，绝大多数患者最终会因多器官衰竭、出血、休克而死亡，死亡率高达50%～90%[2]。埃博拉病毒是一种极度危险的急性出血热病毒。

2 埃博拉病毒病疫情

EVD疫情首次暴发于1976年刚果民主共和国（前扎伊尔），随后在苏丹、刚果共和国、加蓬、乌干达等非洲国家均有暴发，规模不一[3-4]。2014年，西非EVD疫情大规模暴发后，埃博拉病毒成为了全球的关注重点[5]。2017—2018年，刚果民主共和国先后又暴发2次EVD。截至2018年8月30日，该国EVD疫情仍未解除。

3 埃博拉疫苗

埃博拉疫苗是防止EVD传播的有效手段。在设计疫苗时，通常以产生足够保护效果的体液免疫和细胞免疫为目标，经过动物模型的验证后，再进行临床试验。对于埃博拉病毒而言，包膜糖蛋白（glycoprotein, GP）在其感染和致病中具有关键作用，能被宿主细胞强烈识别。因此，现阶段埃博拉疫苗的设计均是围绕GP开展的，临床评价中最常用的指标为GP特异性抗体水平。1980年，首个灭活埃博拉疫苗被证明能够在豚鼠模型中实现免疫保护，但是这类疫苗在非人灵长类动物攻毒实验中并没有展现出较好的保护效果[6]。随着EVD疫情的频发及其规模的增大，越来越多的力量投入到埃博拉疫苗的研发工作中。截至目前，共有几十余种埃博拉疫苗进入临床前研究或临床研究阶段，主要类型包括DNA疫苗、蛋白疫苗、病毒样颗粒疫苗、复制子疫苗、复制缺陷型疫苗、重组病毒载体疫苗等[7-10]。重组病毒载体疫苗又分复制型和非复制型。目前，DNA疫苗、蛋白疫苗和重组病毒载体疫苗均已进入临床试验阶段。

3.1 DNA疫苗 DNA疫苗通常是表达免疫原性抗原的质粒，具有易于开发，生产成本低，几乎没有感染风险的优点。美国国家过敏和传染病研究所研发的DNA疫苗编码3种已知亚型的埃博拉病毒的蛋白质粒：Sudan型GP、核蛋白（nuclear protein, NP）和Zaire型GP，在2002年底开展I期临床试验[11]。结果表明，20名接种疫苗的受试者均产生了至少针对1种蛋白的特异性抗体，其中有6名受试者产生了GP特异的CD8+T细胞反应。2008—2012年，该团队又陆续开展了新改进DNA疫苗的I期和Ib期临床试验，以检验其安全性和免疫原性[12-13]。在美国开展的I期临床试验中，2组受试者分别接受了马尔堡疫苗和埃博拉疫苗；而在乌干达开展的Ib期临床试验则设置了3个试验组，分别为马尔堡疫苗组，埃博拉疫苗组和同时免疫的二联疫苗组。两个临床试验结果均表明该DNA疫苗具有较好的安全性，并且能使部分疫苗接种者产生抗原特异性的体液免疫和细胞免疫应答。2015年，Inovio制药公司和GeneOne Life Science公司合作开发的埃博拉疫苗INO-4212（包含编码先前病毒株序列INO-4201和当前病毒株序列INO-4202两种成分）进入I期临床试验（NCT02464670），在比较肌肉接种和皮肤接种的免疫效果的同时，还考察INO-9012（含IL-12 DNA序列）免疫刺激物的作用，但目前尚未见到相关研究结果的报道。尽管如此，DNA疫苗免疫程序复杂，效率相对较低，免疫原性弱等缺点，使其难以在大规模人群紧急预防接种中充分发挥作用。

3.2 蛋白疫苗美国NOVAVAX公司根据Makona病毒株序列，研发了重组埃博拉病毒GP纳米疫苗（Ebola GP Vaccine）。2015年7月，该公司公布了I期临床试验结果[14]。该试验以递增剂量使用或不使用Matrix-M佐剂，受试者接受1次或2次肌肉注射，并在免疫后28 d和35 d评价免疫反应。试验结果初步证明该疫苗配合Matrix-M佐剂具有较好的免疫原性和耐受性。

3.3 非复制型病毒载体疫苗重组病毒载体疫苗的优势在于能够快速表达目的抗原，激发较强的免疫反应。大部分病毒载体埃博拉疫苗表达的都是埃博拉病毒的GP。目前，已经进入临床试验阶段的非复制型病毒载体埃博拉疫苗包括改良安卡拉载体埃博拉疫苗（MVA-BN Filo）、非复制型人26型腺病毒载体埃博拉疫苗（Ad26-ZEBOV）、复制缺陷型黑猩猩3型腺病毒载体埃博拉疫苗（ChAd3-EBO-Z）、复制缺陷型人5型腺病毒载体埃博拉疫苗（Ad5-EBOV）和埃博拉病毒病联合载体疫苗（GamEvac-Combi）。其中Ad5-EBOV（中国）和GamEvac-Combi（俄罗斯）已经获批在本国注册。

3.3.1 MVA-BN Filo MVA-BN Filo由丹麦生物制药公司Bavarian Nordic与美国国家过敏与传染病研究所共同研发生产。该疫苗以改良痘病毒为载体，同时表达马尔堡病毒、Zaire型和Sudan型埃博拉病毒的GP以及Tay forest型埃博拉病毒的NP，被用作其他埃博拉疫苗接种后的异源加强免疫，能够有效延长免疫反应的持续性。

3.3.2 Ad26-ZEBOV Ad26-ZEBOV由美国强生公司旗下制药公司Janssen研制。在一项临床前研究中，研究者对利用MVA-BN Filo与Ad26-ZEBOV以初免-加强免疫的方式进行研究，发现了较好的免疫效果，并由此展开合作推进疫苗开发的计划。2016年4月，Milligan等[15]在美国医学会杂志上发表了Ad26-ZEBOV首次免疫和MVA-BN Filo加强免疫的I期临床试验结果。该临床试验将87名受试者分为5组：2组分别在免疫Ad26-ZEBOV的28、56 d后进行MVA-BN Filo加强免疫；2组分别在免疫MVABN Filo的28、56 d后进行Ad26-ZEBOV加强免疫；1组为开放组，在免疫MVA-BN Filo的14 d后进行Ad26-ZEBOV加强免疫。研究结果表明，采用Ad26-ZEBOV初免和MVA-BN Filo加强免疫的方案能获得较好的免疫效果。采用该接种方案加强免疫8个月后，所有接种疫苗的受试者体内抗体仍然维持在高水平。

3.3.3 ChAd3-EBO-Z ChAd3-EBO-Z由美国国家过敏与传染病研究所研制，英国制药企业葛兰素史克公司合作开发。目前已经完成10余项I、II期临床试验研究。2014年9—11月，该疫苗陆续在美国、英国、马里和瑞士开展临床试验项目[16-19]。在美国开展的首个I期临床试验探究了不同剂量的ChAd3-EBO-Z（2.0×1010vp和2.0×1011vp）的安全性和免疫原性，结果表明疫苗接种产生的免疫应答具有剂量依赖性，且以2×1011vp剂量免疫后产生的GP抗体水平处于已报道的非人灵长类实验中疫苗诱导的保护性免疫范围内[16]。在随后的临床试验中，研究团队对该疫苗的更多剂量以及采用MVA-BN Filo疫苗加强免疫策略的效果进行探索[19]。结果表明，异源加强免疫策略可以提高体液和细胞免疫反应，并且延长免疫应答的持久性。2015年1月，原计划在利比里亚开展的III期临床试验由于招募人数不足，更改为扩大的II期临床方案。试验结果表明，疫苗接种12个月后抗体水平仍能基本维持[20]。

3.3.4 Ad5-EBOV Ad5-EBOV由中国人民解放军军事医学研究院生物工程研究所和康希诺生物股份公司共同研发。疫苗的载体为复制缺陷型人5型腺病毒，表达2014型Zaire-Makona GP，疫苗剂型为冻干粉剂，其首个临床试验于2014年在江苏泰州开展[21]。120名受试者按照1∶1∶1的比例随机分至低剂量组（4.0×1010vp）、高剂量组（1.6×1011vp）及安慰剂组，接种后半年进行同源加强免疫，并继续观察1年[22]。研究结果表明，1.6×1011vp Ad5-EBOV单针接种能在免疫后14 d激发水平较高的特异性体液和细胞免疫。加强免疫后诱导产生的体液免疫反应，其水平要高于初次免疫，这种差异在高剂量组中更加明显。加强免疫12个月后，高、低剂量组的抗体水平仍然维持在相对较高的水平。2015年3月，该团队开展了针对在华非洲人群的I期临床试验，设置8.0×1010vp 和1.6×1011vp 2个剂量组，该剂量下疫苗在非洲人群中表现出较好的安全性和免疫原性[23]。同年10月，Ad5-EBOV塞拉利昂II期临床试验正式开展，共招募受试者500名，按一定比例随机分至低剂量组（8.0×1010vp）、高剂量组（1.6×1011vp）和安慰剂组[24]。临床试验结果表明，Ad5-EBOV对于塞拉利昂健康成年人不仅安全，而且具有高度的免疫原性。同时，8.0×1010vp也是免疫的最佳剂量。

3.3.5 GamEvac-Combi 由俄罗斯研制的GamEvac-Combi是一种联合疫苗，表达埃博拉病毒Makona GP的重组水疱性口炎病毒减毒株（VSV-GP）和复制缺陷型人5型腺病毒（Ad5-GP）。该疫苗目前完成一项I/II期合并进行的临床试验[25]。在I期方案中，各有12名受试者接受VSV-GP或Ad5-GP的免疫，评价疫苗的安全性；在II期方案中，将60名受试者均分至半剂量组和全剂量组中，每组受试者在免疫VSV-GP 21 d后，进行Ad5-GP免疫。临床试验为GamEvac-Combi的安全性和免疫原性提供了较好的数据支持。该疫苗目前在几内亚和俄罗斯开展IV期临床试验，预计招募受试者人数为2000名。

3.4 复制型病毒载体疫苗美国Profectus公司和Merck公司均开发了以水疱性口炎病毒为载体的埃博拉疫苗。前者（Rvsv N4CT1 EBOVGP1 vaccine）在2016年完成了I期临床试验（NCT02718469），而后者（rVSV-ZEBOV）则是目前为止临床试验进度最快，研究数据最丰富的埃博拉疫苗，临床试验情况见表1。rVSV-ZEBOV由加拿大公共卫生署开发，授权给NewLink Genetics公司（产品名BPSC-1001），后者开始疫苗的初期临床试验和GMP车间生产。随后，又转让给Merck公司（产品名V920），从事疫苗的后期开发工作。2015年，该疫苗率先在几内亚完成III期临床试验。2018年5月，刚果民主共和国新发EVD疫情，Merck公司先后向WHO提供疫苗共计15 000余份，实施环形接种，防止疫情进一步扩散。下面将从安全性、免疫原性、长期有效性和整合免疫学研究方面对此疫苗展开介绍。

3.4.1 安全性作为减毒活疫苗，rVSV-ZEBOV的安全性一直是人们关注的重点。2014年10—11月，该疫苗I期临床试验在美国、非洲和欧洲开展，免疫剂量从3.0×103～1.0×108PFU不等[26-27]。在美国开展的临床试验中，最常见的不良事件为注射部位疼痛、肌肉酸痛以及疲劳。在非洲和欧洲临床试验中，免疫剂量在3.0×106PFU以上的110名受试者中有103名（94%）在免疫后3 d仍存在疫苗的病毒血症。免疫后第2周，瑞士51名受试者中有11名（22%）发生关节炎，平均疼痛持续时间为8 d。因为这些不良事件，该临床试验于2014年12月暂停，研究团队重新评估安全性。1个月后该临床试验重新启动，招募部分受试者并将免疫剂量调整为3.0×105PFU。结果表明，降低疫苗剂量可显著降低急性反应，但不能避免关节炎等症状，且会导致抗体反应水平下降[28]。同时，德国和肯尼亚临床试验的40名受试者中有2名（5%）出现自限性疾病，并且分别在另外2名受试者的滑膜液和皮肤水泡中检出病毒，这也证实了水疱性口炎病毒在外周组织中的传播和复制。在另外两项I期临床试验中，大多数不良事件发生在接种疫苗后的第1 d，强度为轻度至中度，持续时间较短，并且也都在疫苗接种后观察到了短暂、低水平、剂量依赖性的病毒血症，没有与疫苗或受试者退出相关的严重不良事件报告[30-31]。由于在所有I期临床试验中均没有与疫苗相关的严重不良事件报告，最终将2.0×107PFU确定为该疫苗的合适免疫剂量，随后开展的II期和III期临床试验均采用该剂量。

2015年7月，评价rVSV-ZEBOV安全性的III期临床试验在美国开展[35]。1197名受试者按照2∶2∶2∶2∶1的比例随机分至联合批次组（3组）、高剂量组（1组）或安慰剂组（1组），分别用3批同剂量疫苗（2.0×107PFU），单批高剂量（1.0×108PFU）或安慰剂进行接种。在接种后第1～42 d记录每日体温和不良事件，在接种后6个月记录严重不良事件。结果表明各组观察到发热的比例分别为20.2%（联合批次组）、32.2%（高剂量组）和0.8%（安慰剂组）。免疫后第1～42 d各组不良事件发生率为关节痛17.1%、20.4%和3.0%，关节炎5.1%、4.2%和0.0%，皮疹3.8%、3.8%和1.5%。共报告21例严重不良事件和2例死亡，经评估均与疫苗无关。该临床试验进一步为rVSVZEBOV提供了安全性数据支持。

表1 rVSV-ZEBOV埃博拉疫苗的临床试验情况Table 1 Clinical trials on rVSV-ZEBOV

3.4.2 免疫原性美国I期临床试验中，2.0×107PFU与1.0×108PFU的rVSV-EBOV免疫效果相当，均显著优于3.0×106PFU[24]。利比里亚II期临床试验比较了 2.0×107PFU rVSV-ZEBOV与2.0×1011vp Ad26-ZEBOV的免疫效果[20]。免疫后1个月，rVSVZEBOV组GP抗体几何平均值为1000 EU/ml，阳性率为83.7%；Ad26-ZEBOV组GP抗体几何平均值为627 EU/ml，阳性率为70.8%。免疫后12个月，rVSV-ZEBOV组GP抗体几何平均值为818 EU/ml，阳性率为79.5%；Ad26-ZEBOV组GP抗体几何平均值为474 EU/ml，阳性率为63.5%。这些结果表明rVSV-ZEBOV在免疫后1个月至1年均能保持较高的抗体水平，其免疫效果要优于Ad26-ZEBOV。

2015年4月，在塞拉利昂开展了一项单剂量的rVSV-ZEBOV II/III期临床试验，实际接种人数8016人，其中有539名受试者参加了免疫原性研究[33]。同年，rVSV-ZEBOV的III期临床试验在几内亚开展[32]。该试验采用了“环形接种”策略：围绕每个新发EVD病例的密接者及其接触者形成环形人群，设置立即接种组和延迟接种组（延迟21 d接种）。中期临床分析结果表明，在接种10 d后，立即接种组未出现感染病例，而延迟接种组则出现16例感染病例，2组结果比较，差异有统计学意义（P=0.045）。这表明rVSV-ZEBOV具有较好的保护性。

加强免疫能够有效提高疫苗免疫效果，增加免疫反应的持续性。Ad26-ZEBOV的异源加强免疫和Ad5-EBOV的同源加强免疫策略都获得了较好的免疫效果。在I期临床试验中，部分受试者在接种rVSV-ZEBOV 28 d后接受同源加强免疫[26]。尽管在随后的28 d内加强免疫组受试者的体液免疫反应水平有所上升，但在初免180 d后2组受试者的体液免疫反应水平已经没有显著性差异。这表明同源加强会在短期内提高体液免疫反应水平，但无法改变免疫反应的持久性。此外，另一项临床试验（NCT02876328）正在考察免疫180 d后进行同源加强免疫的免疫效果和免疫持久性。

3.4.3 长期有效性目前已经完成rVSV-ZEBOV最长时间为2年以上的免疫反应观察。这些受试者来自于2014年非洲和欧洲I期临床试验，分别接种过3.0×105PFU、1.0×107PFU和5.0×107PFU剂量的rVSV-ZEBOV，其中瑞士受试者观察至2年，肯尼亚和加蓬受试者观察至1年[27，29，32]。初免2年后，参与随访的95名瑞士受试者（共102名）中，曾接种1.0×107PFU或5.0×107PFU剂量疫苗且初免28 d时血清反应阳性的44名受试者体内血清反应阳性率为100%（44/44），接种3.0×105PFU剂量疫苗的则为89%（33/37），这些受试者的抗体滴度水平与初免180 d后的水平相当。参与随访的肯尼亚和加蓬各剂量组受试者初免后1年的抗体滴度水平也与初免90 d后的水平相当。此外，利用多变量方法进行统计学分析发现，初免6个月以后的抗体水平可以通过疫苗剂量和疫苗相关性关节炎来预测[32]。研究结果表明一定剂量rVSV-ZEBOV接种可以产生持续性抗体反应，疫苗在无法进行加强免疫时也能发挥保护效果。美国临床试验数据库显示，有多项rVSV-ZEBOV临床试验（NCT02788227，NCT03140774）正在开展中，旨在探索该疫苗的长期免疫反应。

3.4.4 整合免疫学研究临床试验中，研究者通常利用血清学和细胞免疫学检测技术获取疫苗免疫反应信息。rVSV-ZEBOV是目前惟一将常规免疫学数据和不同层次的组学数据进行整合分析的埃博拉疫苗[36]。在美国I期临床试验中，Fouzia团队检测了ZEBOV-GP特异的循环滤泡辅助T细胞，并发现其与抗体滴度以及滤泡T辅助细胞亚群水平显著相关[37]。德国完成的I期临床试验中，Dahlke 等[38]发现相比其他2组受试者，2.0×107PFU剂量组受试者能引发更强大的细胞因子互锁网络，这也是rVSV-ZEBOV的首个细胞介导免疫谱；而Rechtien等[39]则针对2组高剂量受试者的样本，利用系统疫苗学来寻找rVSV-ZEBOV的早期先天免疫反应信息，通过多细胞因子水平、天然免疫细胞亚群和基因表达的整合分析，发现IP-10与rVSV-ZEBOV诱导的天然免疫反应密切相关。在另外2项临床试验中，Angela团队通过分析受试者血浆样本中细胞因子水平变化的特征，揭示了单核细胞可能在rVSV-ZEBOV安全性和免疫原性方面发挥重要作用[40]。这些研究表明，通过整合多方面数据进行免疫学研究，可以更好地理解疫苗诱导免疫反应的机制和关键因素，有利于鉴定和预测疫苗诱导免疫应答的水平。

4 结语

2014年西非大规模暴发的EVD疫情将多个埃博拉疫苗快速推向临床研究阶段（见表2）。目前看来，病毒载体埃博拉疫苗具有较好的前景。该类疫苗诱导的免疫反应具有响应快、水平高、持续较久的优点，尤其是rVSV-ZEBOV，已经成功在西非人群中证明了其较好的保护效果。考虑到非洲大部分地区经济水平相对落后，电力系统难以保障，液体制剂疫苗的冷链运输和保存是其须要重点解决的问题之一。此外，未来埃博拉疫苗的临床研究可能须要关注以下几个方面。①根据免疫需求，进一步探索疫苗预防性接种和暴露后接种的保护效力；②针对不同人群，调整免疫策略以实现的免疫反应的快速性和持久性；③利用系统疫苗学，对临床数据进行充分挖掘，解读疫苗免疫标志物，以指导疫苗的设计优化和免疫反应的预测。