聚乙烯醇微球的制备与表征

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(1.华东师范大学物理与材料学院，上海市磁共振重点实验室，上海 200062； 2.苏州博创同康生物工程有限公司，江苏 苏州 215300)

1 前 言

1955年Vanderhoff[1]等成功地合成了单分散的聚苯乙烯微球，开辟了高分子科学的新研究领域。高分子微球不仅有固相化载体特有的易于分离和提取的优点，还具有廉价、比表面积大、单分散性好、易于制备及功能化等特点[2]。目前，高分子微球已广泛运用于材料科学，化学工程等领域[3]。

聚乙烯醇是一种由聚醋酸乙烯醇解而得到的水溶性高分子，它是一种水溶性高分子材料，具有良好的成膜性及成膜后的抗拉强度、耐磨损性及耐弯曲性等机械性能[4]，被广泛应用于纤维加工、纸加工、薄膜等制造工业[5]；PVA也可以与其他材料混合，形成复合材料。孙复钱等[6]采用静电纺丝技术制备聚乙烯醇/二氧化钛复合纳米纤维膜，这种材料具有良好的光催化性能，有望在环境污染治理、污水处理等领域得到应用。PVA还具有良好的生物相容性和生物可降解性，近年来相继开发了聚乙烯醇水溶液在眼科[7]、伤口敷料[8]和人工关节[9]等方面的应用，聚乙烯醇薄膜在药用膜，人工肾膜[10]、血管移植[11]等方面的应用；聚乙烯醇微球在药物缓释[12]方面的应用。

以往研究中，作为PVA的交联剂通常为醛类[13]，也有的会使用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)[14]做为交联剂，但都有一定的毒性。三偏磷酸钠(STMP)是一种对人体无毒的钠盐，为白色结晶或白色粉末，易溶于水，在食品工业中用作淀粉改性剂、果汁饮料防混剂、肉制品保水、黏合剂、分散剂、稳定剂等[15]。本文以三偏磷酸钠为交联剂，与以往常用的交联剂(如甲醛，戊二醛，环氧氯丙烷等)相比，会使交联得到的微球具有更好的生物相容性。而采用反相悬浮的方法制备聚乙烯醇微球，则可以得到粒径分布均匀，球型较佳的微球，这为之后将聚乙烯醇微球作为一种安全的体内植、介入材料，成为一种药物缓释载体提供了基础。

2 实 验

2.1 主要仪器与试剂

以聚乙烯醇(PVA 124，化学纯)为原料，三偏磷酸钠(STMP，化学纯)为交联剂，液体石蜡(化学纯)和失水山梨醇单油酸酯(span-80，化学纯)为油相，氢氧化钠(分析纯)为催化剂来制备聚乙烯醇微球。在制备过程中，向样品加入无水乙醇(分析纯)和异丙醇(分析纯)进行离心处理。

在实验过程中，需要用到的仪器有：电子天平(JA2003)，酸度计(PHS-25)，鼓风干燥箱(CT-C)，离心机(YXJ-B)，恒温数显磁力搅拌器(WYP 11-2)。制备微球后，利用傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet Nexus 670)和核磁共振波谱仪(AVANCE Ⅲ)分析交联产物的结构；通过扫描电子显微镜(S-48000)以及生物显微镜观察微球的表面形貌，并分析微球的粒径分布和平均粒径大小；利用表面接触角测量仪(Easy Drop FM40)测量微球的表面接触角，分析微球的亲水性。

2.2 聚乙烯醇微球的制备

在搅拌条件下，向40mL液体石蜡中加入2.0g表面活化剂Span-80，构成连续油相；搅拌一段时间后，向油相中加入10mL质量分数为5%的PVA，充分混合后，加入2.0g STMP作为交联剂，最后加入1mL NaOH作为催化剂。设置转速为400r/min，在50℃反应 16h。

交联反应结束后，静置30min。加入少量的无水乙醇，放入离心机中进行离心分离，取出上清液，将沉淀物反复用无水乙醇，异丙醇以及纯水洗涤，最后放入鼓风干燥箱中干燥24h，得到白色粉末。

2.3 测试与表征

将PVA原料和干燥后的PVA微球分别与溴化钾混合研磨、压片后在3900～600cm-1范围内进行红外扫描测试。比较反应前后的特征峰，分析产物的结构，确定交联产物的生成。

采用AVANCE Ⅲ 300MHz 固体核磁共振波谱仪测定产品波谱，并用高功率质子去耦31P NMR光谱分析样品。该仪器1H的共振频率为300.16MHz，31P的共振频率为121.50MHz，样品粉末放入直径为5mm的Zro转子中，转速为8kHz。P的化学位移以85%的磷酸作为参考。所有的循环延迟时间为5s，扫描1024次。

取一定量未经筛分的微球，置于扫描电镜下，观测微球的表面形貌以及计算微球的平均粒径。

Dn=Σnidi/Σni

(1)

其中，Dn为平均粒径，di为微球的直径，ni为该粒径微球的数目。

采用座滴法测量微球接触角，使用去离子水作为液体样品。取一定量聚乙烯醇微球，压片，放入样品台上，调整样品台高度，让聚乙烯醇压片能够承接挤出的液滴，并能在其表面形成液滴。记录此时的接触角大小，并多次测量，取平均值。

精密称取PVA微球50mg(W1)，将其浸泡于0.9%的生理盐水中，分别在浸泡15，30，45，60，75及90min时取出微球，擦干微球表面的水分进行称重(W2)。按式(2)计算溶胀率，并绘制溶胀率与时间的关系曲线：

(2)

取50mL质量分数为25%的Nacl溶液，向其中加入50mg PVA微球粉末，超声振荡将微球打散；将pH计插入到配置好的溶液中，用磁力搅拌器慢速搅拌；一边搅拌一边向其中加入浓度为0.1mol/L的HCl准溶液，使得溶液的pH值为4；最后向混合溶液中滴加浓度为0.01mol/L的NaOH标准溶液进行反滴定，滴定到pH值为9，而且保持5min不变时方可视为滴定终点。并用式(3)计算微球表面所含羟基的数量：

(3)

其中，N为羟基的数量，V为所用NaOH的体积(单位为ml)，M为PVA的质量，即0.05g。

3 结果与讨论

3.1 PVA的反应机理

STMP作为交联剂，在碱性的条件下，易与聚合物中的-OH基团发生交联酯化反应。据文献[13]推测，其反应如Scheme 1所示。

PVA和STMP在碱性条件下发生交联反应的化学反应方程(a) 醇化物的形成； (b) STMP在碱性条件下的分解； (c) STMP的开环； (d) 单磷酸酯的形成； (e) 焦磷酸钠的形成。Scheme 1 STMP reaction with poly(vinyl alcohol)(ROH) in alkaline medium. Alcoholate formation(a), alkaline degradation of STMP(b), STMP opening (c), monophosphate crosslinking formation (d) and pyrophosphate crosslink formation(e)

3.2 红外谱图分析

由于PVA中含有大量的-OH，会与STMP发生酯化反应产生交联，生成磷酸酯类产物。对照PVA和交联之后的PVA谱图可以发现(见图1)，交联之后的PVA在3200～3500cm-1范围内的羟基峰有所变化，说明STAM与PVA中的羟基发生了反应。在2937cm-1处的吸收峰为主链亚甲基(-CH2-)的不对称伸缩振动峰。该峰在交联之后的PVA中变得圆滑，且峰的强度有所降低。在1165cm-1处，出现了新的吸收峰，根据文献[15]，可把其归结为P=O的振动峰。在1095cm-1处为C-O的吸收峰，对比两图可发现，此处的吸收峰强度变强，是原料和三偏磷酸钠交联之后生成P-O-C基团造成的[16]。

图1 红外图谱(1是PVA，2是STMP交联之后的PVA)Fig.1 FT-IR spectra of PVA without (1) and with crosslinking by STMP (2)

图2 31P核磁谱图(样品1:STMP；样品2：PVA；样品3：PVA和STMP的物理混合；样品4：PVA和STMP的化学交联)Fig.2 Nuclear Magnetic Resonance spectra(Sample 1:STMP; Sample 2:PVA; Sample 3: the physical blending of PVA and STMP; Sample 4: the chemical crosslinking of PVA and STMP)

3.3 核磁波谱分析

图2中，由Sample 2谱可知，PVA中不存在P元素；对比Sample 1和Sample 3谱可以发现，PVA和STMP物理混合的谱和STMP原料的谱相同，说明物理混合后，没有新产物生成；根据文献[17]可知，在-19.05ppm处为STMP的特征峰，代表P=O；除此以外在5.47ppm，-4.89ppm，-15.75ppm处出峰，这是由于在制备STMP过程中的副产物残留，由文献[18,19]可知，其分布对应磷酸钠、焦磷酸钠、多聚磷酸钠；将sample 4谱与Sample 1或Sample 3谱对比可以发现，sample 4谱在多处出现新的峰，根据Sang[20]等人对STMP与-OH发生交联反应之后的产物的31P谱图的分析可推断得：-16.03ppm处对应的产物为三磷酸单聚物(如：单聚乙烯醇三磷酸(MPTP))，-6.38ppm处推断是单聚乙烯醇双磷酸酯(MPDP)的特征峰,而2.72ppm处可归属于单聚乙烯醇单磷酸酯(MPMP)和双聚乙烯醇单磷酸酯(DPMP)。从sample 4中还可以发现在-19.3ppm处仍然存在着P=O的特征峰，以及-18.30ppm处对应的三聚磷酸钠(STPP)的峰，这是因为PVA的粘性比较大，故无法将产物中的杂质完全清除所致[21]。从反应前后的谱图的差异可以看出：PVA与STMP之间发生了交联反应。

3.4 扫描电镜分析

从图3可见，微球的表面形貌良好，粒径较均匀。根据SEM照片中微球的数目，以及每个粒径范围内微球的数量，绘制出图4所示的粒径分布图。

图3 PVA微球的扫描电子显微镜照片Fig.3 SEM image of PVA microspheres

图4 PVA微球的粒径分布图Fig.4 Image of particle size distribution of PVA microspheres

综合所有的微球SEM照片可知，微球的粒径大致分布在1～20μm之间，根据公式计算得出微球的平均粒径为11.5μm。

载药微球系药物与高分子材料制成的球形或类球形实体，通常粒径范围为1 ～ 250μm。药物微球相较于一般的给药系统，具有更好的靶向性。目前，药物微球的给药途径有注射给药、口服给药、肺部给药和鼻腔给药等，而微球粒径的大小就影响着给药途径。本文的PVA微球的粒径可满足药物载体对微球粒径的要求。而由文献[22]可知，PVA水溶液的浓度、PVA与STMP的比例，交联时间、转速、催化剂的用量等都会影响微球的粒径分布。

3.5 接触角测定

接触角是表征液体在固体表面润湿性的重要参数之一，其可以反映液体在一定固体表面的润湿程度。若θ<90°，则固体表面是亲水性的，即液体较易润湿固体，其角越小，表示润湿性越好；若θ>90°，则固体表面是疏水性的，即液体不容易润湿固体，容易在表面上移动。

由于PVA微球表面含有大量羟基，所以具有很好的亲水性，以致于液体样品不能在PVA微球表面形成液滴，而是在非常短的时间(1s)内浸入到压片中，如图5所示。

3.6 溶胀率分析

分别在0～90min时取7个时间点，每隔15min从生理盐水中取出PVA微球，擦干表面水分后称重，计算微球的溶胀率，并绘制出溶胀率与时间的关系曲线，如图6所示。

从图可见，干燥微球在0～15min内快速膨胀，15～30min内溶胀速率逐渐降低，至30min时达到饱和状态，微球的饱和溶胀率为119.6%。

微球作为药物载体进入体内后，在体液的作用下膨胀。膨胀的过程中，会使得微球表面的孔隙增大，以达到释放药物的效果。本文制备的PVA微球在生理盐水中30min后到达饱和，饱和溶胀率为119.6%，这为PVA微球作为载药释药系统奠定了基础。

3.7 微球表面所含羟基数量

按照第2.3节中的实验步骤，最终所使用的0.01 mol/L NaOH溶液的体积为0.15mL，按式(3)计算微球表面所带羟基的数量为：

图5 PVA微球接触角 (a) t=0.2s; (b) t=0.4s; (c) t=0.6s; (d) t=0.8s; (e) t=0.9s; (f) t=1.0sFig.5 Contact angle (a) t=0.2s; (b) t=0.4s; (c) t=0.6s; (d) t=0.8s; (e) t=0.9s; (f) t=1.0s

图6 PVA微球的溶胀曲线和溶胀率Fig.6 Curve of the relation of time and the swelling rate

4 结 论

本文用一种无毒的、生物相容性更佳的STMP作为交联剂，采用反相悬浮—化学交联的方法，制备PVA微球。

通过FTIR和NMR对交联产物的结构进行分析，发现 STMP可以与PVA中的-OH发生酯化反应，验证了STMP的确与PVA发生了交联反应，并推测出了PVA与STMP的反应机理：一分子STMP可以与两分子PVA发生交联反应，交联过程分为两步，第一步生成三聚磷酸钠(STPP)和单聚乙烯醇三磷酸酯(STPPg)；第二步生成了双聚乙烯醇单磷酸酯(Pc)和焦磷酸钠(PPi)以及双聚乙烯醇双磷酸酯(PPc)和磷酸钠(Pi)。

利用SEM观察到交联之后的微球球型良好，微球的粒径大致分布在1～20μm之间，根据公式计算得出微球的平均粒径为11.5μm。

由接触角的测定分析说明制备得到的交联PVA微球保留有良好的亲水性，而生物材料的亲水性会影响到细胞在材料表面的吸附以及基因表达，以此影响着生物材料的生物相容性[23]。

由公式测得微球在生理盐水中的饱和溶胀率为119.6%。PVA微球的这些性能为之后应用于载药释药系统研究提供了理论依据。