沉默FGF4表达对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制

曲杰，魏依兰，梁云薇，吕喜英，李青山

(承德医学院附属医院，河北承德 067000)

2012年全球统计数据显示，每年大约有167万女性被确诊为乳腺癌，死亡人数接近52万[1]。近年来，我国乳腺癌的发病率逐年升高，并呈年轻化趋势。尽管目前在乳腺癌的诊断和治疗上取得了很大进展[2，3]，但对其发病机制仍不十分清楚。成纤维细胞生长因子(FGF)是参与血管生成、伤口愈合、胚胎发育及各种内分泌信号转导通路的一类生长因子。研究发现，FGF及其受体(FGFR)组成的信号转导通路能调节肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[4]。成纤维细胞生长因子4(FGF4)是FGF家族中的成员之一，是许多间充质和神经外胚层起源细胞的促分裂素，在胚胎生长、发育及血管形成等多种生理过程中具有重要作用[5]。但目前鲜见FGF4对乳腺癌细胞增殖和凋亡影响的报道。2014～2017年，我们观察了沉默FGF4表达对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，现分析结果并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人乳腺癌细胞MCF-7(以下称MCF-7细胞)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库。siRNA序列5′-CGAUGAGUGCACGUUCAAGDTDT-3′、阴性对照序列5′-AACGGAGTATCTGCACGTGDTDT-3′，由华大基因科技有限公司合成。流式细胞仪，美国BD公司；酶标仪，美国Bio-Rad公司；台式低温高速离心机，德国Eppendorf公司；电泳系统和转膜系统，北京六一生物科技有限公司。LipofectamineTM2000转染试剂、鼠抗人第二抗体，美国Invitrogen公司；FGF4单克隆抗体，美国Sigma公司；cyclin D1、caspase-3单克隆抗体，美国Abcam公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、全细胞蛋白抽提试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒，江苏碧云天生物技术研究所；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒，杭州联科生物技术股份有限公司。

1.2 MCF-7细胞培养 将MCF-7细胞接种于含10% FBS的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。当细胞融合70%～80%时，0.25%胰蛋白酶消化传代。取传2代对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 MCF-7细胞FGF4沉默及效果验证 ①细胞转染：取传2代对数生长期MCF-7细胞，用无血清的DMEM完全培养液重悬，制成密度为5×105个/mL的细胞悬液。取细胞悬液1 mL接种于6孔板，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中，随机分为FGF4沉默组、阴性对照组、空白对照组，每组设3个复孔。当细胞融合40%～60%时，FGF4沉默组、阴性对照组按脂质体LipofectamineTM2000转染试剂说明分别转染siRNA、阴性对照序列，空白对照组不予转染。各组转染6 h，更换新的完全培养基，再培养48 h，收集细胞。②转染效率验证：采用Western blotting法。收集各组再培养48 h细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量合格，然后加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白30 μg，SDS-PAGE(5%浓缩胶、12%分离胶)分离蛋白，以80 V电压进行浓缩胶跑样，待电泳条带跑出浓缩胶并进入分离胶时将电压调至120 V，直至溴酚蓝跑出分离胶最下端时停止电泳。电泳结束，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入鼠抗人FGF4单克隆抗体(1∶1 000)、鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶3 000)，室温孵育1 h，充分洗膜后，ECL化学发光，暗室中显影、定影。采用Quantity One软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。结果显示，FGF4沉默组FGF4蛋白相对表达量为2.35±0.19，阴性对照组为9.73±0.46，空白对照组为9.56±0.53，FGF4沉默组FGF4蛋白相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，而阴性对照组与空白对照组比较P>0.05。说明siRNA序列能够抑制MCF-7细胞FGF4蛋白表达。

1.4 相关指标观察

1.4.1 细胞增殖能力 采用MTT法。收集各组转染48 h细胞，0.25%胰蛋白酶消化、计数，用无血清的DMEM完全培养液重悬，制成密度为5×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液100 μL接种于96孔板，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中常规培养。分别于培养24、48、72 h，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，继续孵育4 h；小心吸弃孔内培养上清液，加入DMSO 200 μL，微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶充分溶解。酶标仪于490 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，计算细胞增殖率。细胞增殖率=(1-实验孔OD490值/对照孔OD490值)×100%。每组设6个复孔。实验重复3次，取平均值。

1.4.2 细胞凋亡率 采用流式细胞术。收集各组转染48 h细胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，预冷的结合缓冲液重悬，制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。取细胞悬液500 μL，置于流式管中，然后加入Annexin V-FITC 5 μL和PI 10 μL，混匀，室温避光孵育5～15 min，1 h内上流式细胞仪自动检测早期凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.4.3 cyclin D1、caspase-3蛋白表达 采用Western blotting法。收集各组转染48 h细胞，采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量合格，然后加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白30 μg，SDS-PAGE(5%浓缩胶、12%分离胶)分离蛋白，以80 V电压进行浓缩胶跑样，待电泳条带跑出浓缩胶并进入分离胶时将电压调至120 V，直至溴酚蓝跑出分离胶最下端时停止电泳。电泳结束，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入cyclin D1、caspase-3单克隆抗体(1∶500)和抗β-actin单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)，室温孵育1 h，充分洗膜后，ECL化学发光，暗室中显影、定影。采用Quantity One软件分析各蛋白电泳条带灰度值。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 各组细胞增殖抑制率比较

注：与空白对照组同时间比较，*P<0.05；与阴性对照组同时间比较，#P<0.05；与同组培养24 h比较，△P<0.05；与同组培养48 h比较，▽P<0.05。

2.2 各组细胞早期凋亡率比较 空白对照组、阴性对照组、FGF4沉默组早期凋亡率分别为(2.76±0.04)%、(2.84±0.07)%、(5.79±0.09)%。与阴性对照组和空白对照组比较，FGF4沉默组早期凋亡率明显升高(P均<0.05)，而阴性对照组与空白对照组比较P>0.05。

2.3 各组cyclin D1、caspase-3蛋白表达比较 与阴性对照组和空白对照组比较，FGF4沉默组cyclin D1蛋白相对表达量明显降低，caspase-3蛋白相对表达量明显升高(P均<0.05)，而阴性对照组与空白对照组cyclin D1、caspase-3蛋白相对表达量比较P均>0.05。见表2。

表2 各组cyclin D1、caspase-3蛋白相对表达量比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，#P<0.05。

3 讨论

FGF家族是一个多基因家族，到目前为止至少拥有23个家族成员，其家族成员存在于从线虫到人类的所有生物体内[6]。FGF家族成员FGF4、FGF9、FGF18等均为wnt/β-catenin信号传导通路的直接下游靶基因[7～9]，而wnt/β-catenin信号传导通路在人类肿瘤的发生、发展中具有重要作用。目前已有研究证实，FGF4可作为癌基因，促进纤维瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤等肿瘤的发生、发展[10～12]。但其是否参与乳腺癌的发生、发展尚不清楚。

本研究采用RNA干扰技术沉默MCF-7细胞FGF4表达，并观察沉默FGF4表达对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。结果发现，FGF4沉默组转染后再培养24、48、72 h时细胞增殖抑制率均明显高于阴性对照组和空白对照组，而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义。本研究还发现，FGF4沉默组早期凋亡率明显高于阴性对照组和空白对照组，而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义。结果表明，FGF4基因可促进乳腺癌细胞增殖并抑制其凋亡，在乳腺癌的发生、发展中起促癌基因作用；特异性干扰FGF4表达可抑制MCF-7细胞增殖并促进其凋亡。

恶性肿瘤最主要的特征是无限增殖，即肿瘤细胞具有永生化特征，而肿瘤细胞永生时细胞周期发生紊乱，细胞增殖体系不受控制。cyclin D1是调控细胞周期的关键蛋白，与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)特异性结合形成cyclinD1-CDK复合物，从而促进细胞增殖能力[13]。本研究结果显示，FGF4沉默组cyclin D1蛋白相对表达量明显低于阴性对照组和空白对照组，而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义，提示沉默FGF4表达后MCF-7细胞增殖能力降低，其原因可能与cyclin D1蛋白表达降低有关。肿瘤细胞凋亡主要有三个途径，即细胞外死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径[14]。在这三条途径中半胱氨酸蛋白酶caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，在细胞凋亡中具有重要作用。本研究结果发现，FGF4沉默组caspase-3蛋白相对表达量明显高于阴性对照组和空白对照组，而空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义，提示沉默FGF4表达后MCF-7细胞凋亡增多可能与激活caspase-3参与的凋亡信号通路有关。

综上所述，沉默FGF4表达可抑制乳腺癌细胞增殖并促进其凋亡，其机制可能为抑制cyclin D1、促进caspase-3蛋白表达。但乳腺癌细胞增殖与凋亡调控是一个多因素参与的复杂过程，FGF4调节下游靶基因cyclin D1、caspase-3表达的具体信号通路还有待进一步研究证实。