回医烙灸疗法对脊髓损伤大鼠Notch信号通路中Presenilin1、Hes1蛋白表达的影响

夏 铂，范 灵

(宁夏医科大学，银川 750004）

脊髓损伤是一种临床上比较严重的损伤性疾病，目前并没有特别有效的治疗手段，仅停留在对症治疗。回医烙灸疗法是一种治疗脊髓损伤的新方法，在临床上已经取得一定疗效。本实验取损伤脊髓组织，应用免疫组化法检测大鼠脊髓组织中Notch信号通路中Presenilin1、Hes1蛋白表达，旨在从分子生物学角度探讨回医烙灸疗法对不同介入时间大鼠脊髓损伤后神经修复功能的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 实验在宁夏医科大学实验动物中心完成，选取清洁级SD大鼠75只（宁夏医科大学实验动物中心提供，12周龄，体质量230～305 g，雄性）。

1.2 方法

1.2.1 分组 选取清洁级SD大鼠75只，随机数字表法分为5组：A 组（假手术组）、 B 组（模型组）、C 组（西药组）、D组（2 h烙灸组）、E组（6 h烙灸组），于第1、7、14、28 d每组各取3只损伤脊髓组织，共取60只，15只备用，免疫组化法检测大鼠脊髓组织中Presenilin1、Hes1蛋白表达。A 组（假手术组），只做椎板切除，不做脊髓损伤；B 组（模型组），脊髓Allen’s打击损伤后灌胃给予一定量生理盐水，持续28 d；C 组（西药组），脊髓Allen’s打击损伤后0.5 h内首次按20 mg/kg醋酸泼尼松，随后按 4.6 mg/（kg·h）给药，3 h连续给药，之后按7.2 mg/（kg·d），连续给药7 d；D组（2 h烙灸组），脊髓Allen’s打击损伤后2 h采用烙灸治疗，烙灸隔日1次，1次5 min，持续28 d；E组（6 h烙灸组），脊髓Allen’s打击损伤后6 h采用烙灸治疗，烙灸隔日1次，持续28 d。各组于术后1 h经皮下注射4万u/kg庆大霉素，1次/d，连续7 d。各组均给予一定量生理盐水，持续28 d。

1.2.2 模型制备 改良的脊髓损伤Allen’s[1]造模。操作：大鼠麻醉、消毒，以T10为中心，沿脊柱方向切约3 cm的切口，切开皮肤、肌肉，分离并暴露棘突，将T10椎板全部切除，保留硬脊膜。采用自制的 Allen’s 改良式打击装置（将 15 g打击棒套入钢管内，卡住打击高度，松开打击棒即可下落） ，高度为5 cm，致伤量为75 g/cm，造成 T10～ T11节段急性脊髓损伤（此致伤量可造成大鼠的不完全性截瘫，属中等程度损伤）。动物出现摆尾反射，双下肢及躯体回缩扑动后，见双下肢不完全瘫痪，标志造模成功。

1.2.3 治疗方法 固定大鼠，回医特制烙灸器放在损伤大鼠两侧夹脊穴（在距损伤上下端两个椎体的棘突间隙旁开距中线3～4 mm处取穴)。回医特制烙灸器利用自制和脊柱形状相似铁质灸具制成，在灸槽内放有艾绒，点燃艾绒，利用铁质灸具热传导，使局部发红，排出异常体液。部位参照《实验针灸学》（上海科学技术出版社）烙灸组于造模后2、6 h分别开始，隔日同一时间重复治疗1次，每次灸5 min，持续28 d，并防止时间过长造成皮肤损伤。

1.2.4 标本采集 每组又按不同时间点分别在1、7、14、28 d各取3只，共取60只，15只备用，处死大鼠，取脊髓损伤部位上下1 cm的脊髓组织，制成免疫组化染色切片，进行免疫组化染色。

1.2.5 免疫组化染色 常规石蜡切片，脱蜡和水化，PBS洗5 min，滴加3%甲醇-H2O2溶液，湿盒室温静置15 min。PBS洗3次各5 min，抗原修复，微波炉中高火力4 min，低火20 min，自然降至室温。PBS洗3次各5 min，滴加正常山羊血清封闭液，室温30～60 min，甩去多余液体，滴加I抗100 μL，4 ℃过夜，37 ℃复温45 min。PBS洗3次各10 min，滴加Ⅱ抗100 μL，室温静置1 h。PBS洗3次各10 min，DAB显色3 min，在显微镜下掌握染色程度。PBS洗 3次各5 min，苏木精复染5 min，自来水洗15 min，脱水、透明、封片、镜检。

1.3 图像采集与统计学方法 每组选取6张图像（400倍），釆用Image-Pro Plus Analysis Soft ware 6.0进行图像分析，选取有效区域进行累积光密度值统计。实验结果以均值±标准差（x± s ）表示。采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理和分析，2组间比较采用t检验，数据正态且方差齐时，釆用单因素方差分析LSD法进行比较，数据非正态和（或）方差不齐时，进行非参数检验。

2 结果

2.1 各组大鼠Presenilin1免疫组化染色统计结果 染色图像Presenilin1免疫阳性信号表达呈现深褐色，主要出现在大鼠脊髓组织中的前角、中央管附近、后角部位。A组大鼠脊髓组织中有极少量阳性细胞显色。B、C、D、E组可见不同程度的颜色改变，B组显色最为明显，D、E组显色较轻。见图1。

图1 各组在术后14 d，免疫组化染色（200×）

统计结果：通过图像分析系统对免疫组化图像光密度的测算，第1、7、14、28 d，B、C、D、E组均大于A组，差异有统计学意义（P＜0.01）。损伤7、14 d，C、D、E组均小于B组，差异有统计学意义（P＜0.01），C、D、E组间差异无统计学意义；损伤28 d，D、E组小于B、C组，且D组表达率最显著减弱，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。2.2 各组大鼠Hes1免疫组化染色统计结果 染色图像Hes1免疫阳性信号表达呈现棕黄色或棕灰色，主要出现在大鼠脊髓组织中的前角、中央管附近、后角部位。A组大鼠脊髓组织中有弱阳性表达。B组大鼠脊髓组织中受损局部Hes1呈强阳性表达，而且较A组显著增强。B、C、D、E组可见黄色、深褐色不同程度的显色，B组显色最为明显，D、E组显色较轻。见图2。

表1 各组大鼠Presenilin1蛋白表达的平均光密度比较（x± s ，n = 12）

图2 各组在术后14 d，免疫组化染色（200×）

统计结果：通过图像分析系统对免疫组化图像光密度的测算，第1、7、14、28 d，B、C、D、E组均大于A组，差异有统计学意义（P＜0.01）。损伤7、14 d，C、D、E组均小于B组，差异有统计学意义（P＜0.01），C、D、E组间差异无统计学意义（P＞0.01）；损伤28 d，D、E组小于B、C组，且D组表达率最显著减弱，差异有统计学意 义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠Hes1蛋白表达的平均光密度比较（x± s ，n = 12）

3 讨论

3.1 关于脊髓损伤大鼠Notch信号通路研究进展 脊髓损伤是由交通伤、坠落伤、跌倒伤、暴力或运动等因素引起的一种高致残性中枢神经系统疾病，不仅会导致受损节段以下的感觉功能、运动功能、以及自主神经功能的障碍，而且会引起其他系统的功能障碍，进而影响到患者心理健康及正常社会交往[2-3]。它是一种常见的中枢神经系统损伤，能造成患者严重的神经功能损害，目前临床上仍缺乏有效的方法来修复脊髓损伤[4-5]。脊髓损伤属中医瘀血所致“痿证”范畴，其致残率和病死率极高[6]。全球每年有数以万计的人遭受脊髓损伤的折磨，对病人产生毁灭性的打击，有效的治疗对于脊髓损伤患者来说不仅可以极大地提高生活质量，还可以减轻他们的心理及经济负担[7]。其中交通事故为脊髓损伤的首要原因，占 46. 9%。其次是工伤事故，占 33. 1%，其他损伤包括运动失误、生活中的损伤、火器伤及锐器伤等[8-9]。 目前，医学界虽然对脊髓损伤的发生机制还不十分清楚，但研究显示，脊髓损伤的发生是一种多因素、多步骤的级联瀑布效应机制[10-11]。现代医学认为，继发性损伤是导致急性脊髓损伤肢体功能障碍的主要原因之一[12]。由于中枢神经结构的特殊性，使脊髓损伤修复的研究经历了漫长而曲折的过程，让损伤的脊髓再生，因此成为许多神经科学家梦寐以求的目标[13]。 Notch信号通路是一条与细胞的生长、发育、凋亡密切相关的信号通路，在神经干细胞的增殖和分化过程中也有着至关重要的作用[14]。Ben-Shushan[15]等研究发现，抑制 Notch信号通路可以促进胚胎干细胞向运动神经元分化。在对神经元生长发育过程的研究中还发现，低水平的Notch信号还可以促进神经突的生长延伸，而上调Notch信号后则抑制神经突的延伸甚至导致神经突的回缩。Notch受体在S3切割位点水解的关键是γ-Secretase，是Notch信号通路的核心环节，而Presenilin1是γ-Secretase的活性中心，Presenilin1与其他几种蛋白质结合成一个蛋白剪接复合体，负责Notch受体在S3切割位点的剪接[16]。Hes1是Notch信号通路的重要基因，Hes1高表达时可以促进神经干细胞的增殖，抑制神经干细胞分化为神经元，而当Hes1的表达减弱时，则可以促进神经干细胞向神经元细胞分化，因此，Hes1在神经干细胞的增殖和分化过程中发挥着重要的调节作用[17]。Grandbarbe[18]研究指出，Notch信号通路抑制神经干细胞向神经元细胞和少突胶质细胞的分化，而促进其向星形胶质细胞分化，而星形胶质细胞又可以通过Jagged1介导的Notch信号通路对神经再生发挥负调节作用[19]。Dias[20]等发现脊髓损伤后抑制Notch信号通路可以加强运动神经元的再生。

3.2 关于回医烙灸疗法 回医烙灸疗法是一种强刺激疗法，它结合腧穴组织特点和经络功能，利用药物、器械加热所产生的火热刺激，通调气血，直接或间接地激发人体内的潜能，通过皮肤和血管感受器的反射途径传到中枢神经系统，调节兴奋和抑制过程。其通过扩张血管，调节循环，增强局部耐受性及机体抵抗力[21]。而脊髓损伤后期气血不调，经络堵塞造成肢体活动不利。治疗正需要回医烙灸强刺激手段，刺激周围神经的敏感度，加强其与大脑中枢神经的联系。它比“化脓灸”疗法操作更加精准，且对皮肤的损伤程度较轻，对元气的振奋与恢复更加迅速[22]。回医在长期临床使用中证实，烙灸疗法对于经络、筋经的不畅，骨与关节损伤性疾病有不可替代的独特疗效。该特色疗法在长期的传承和应用中，积累了丰富的临床经验，治疗效果可靠，对医疗设备设施的依赖小，技术操作便于掌握，适合在基层推广。

3.3 回医烙灸疗法对脊髓损伤大鼠Notch信号通路中Presenilin1、Hes1蛋白表达的影响 观察不同时间点各组大鼠损伤局部Presenilin1、Hes1表达情况，正常组大鼠脊髓组织中的Presenilin1、Hes1表达均没有变化，表明回医烙灸疗法对假手术组大鼠脊髓组织中Notch信号没有影响，在脊髓损伤后的1、7、14 d，模型组大鼠损伤局部的Presenilin1、Hes1表达有显著升高，表明脊髓损伤可以激活大鼠损伤局部Notch信号通路，这可能与脊髓损伤后神经组织的自我修复有关，并持续高表达至损伤后28 d，其持续的高表达可促进内源性神经干细胞的增殖，但是也抑制内源性神经干细胞的分化，这将不利于神经组织的修复，同时其高表达也促进星形胶质细胞的过度增生，过度增生的星形胶质细胞将会促进胶质瘢痕的形成，从而进一步阻碍神经功能的修复。而不同时间点西药组、2 h烙灸组、6 h烙灸组大鼠脊髓组织中受损局部Presenilin1、Hes1的表达都较模型组显著降低，烙灸组降低幅度最大，且2 h烙灸组最显著。结果显示，回医烙灸疗法通过抑制脊髓损伤大鼠局部Presenilin1、Hes1的表达，从而抑制Notch信号通路的表达，使Notch信号通路被抑制，不但促进内源性神经干细胞向神经元细胞和少突胶质细胞的分化，而且还抑制了内源性神经干细胞过度分化为星形胶质细胞，以促进其局部神经的修复，且前期烙灸干预的效果好于后期干预。