化学灼烧法大鼠口腔溃疡动物模型对照优化的研究

陈吉莉，袁盛梦，陈芳园，陈荟宇，韩沛丰，王福

(大连医科大学口腔医学院，大连 116044)

人类口腔黏膜溃疡类疾病以复发性阿弗他溃疡、创伤性溃疡、白塞病、放射性口炎最为常见。临床多表现为溃疡形成，即指口腔黏膜上皮的局限性组织缺损、结缔组织暴露，其内含有神经血管，溃疡形成后疼痛异常，极大影响患者精神状态、饮食及正常生活[1-3]。临床上常用的治疗方法主要分为抗菌疗法、抗炎疗法、免疫调节治疗、麻醉及另类疗法等几大类，通过药膏、贴剂、含片、漱口水、外敷等方法局部给药[4-5]，但疗效均不显著。因此建立一个稳定可靠的口腔溃疡动物模型将为研究口腔溃疡的有效临床治疗提供良好的基础。

目前有关口腔黏膜溃疡动物模型的制备有多种方法，常见有免疫法[6]、化疗法、化学烧灼法[7-11]、氧自由基法[12]、细菌感染诱导法[13]、创伤法[14]及放射法[15-16,20]等，所选动物有兔[7]、大鼠、豚鼠及金黄地鼠等[17-18]。化学灼烧法因方法简便可靠在研究中使用最多，常用的试剂为冰醋酸和氢氧化钠[8-11]。然而，关于化学灼烧法建立口腔溃疡模型的报道中，化学试剂、浓度、处理部位不一，同一部位能否连续建立溃疡还不清楚。因此本研究采用控制变量法研究不同化学试剂、浓度、处理部位及同一部位建立溃疡次数对溃疡模型的影响，以期得到操作方法简便安全、能够标准化、模型结果稳定可靠、处理部位便于后续操作的口腔溃疡模型建立方法，为进一步研究口腔溃疡的有效临床治疗及给药方法奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

8周龄SPF级雄性SD大鼠50只，体重约180～220 g，由大连医科大学SPF动物实验中心提供【SCXK(辽)2013-0003】并饲养，在室温22～25℃，湿度50% ～60%,12 h明暗交替条件下饲养。实验操作在大连医科大学SPF动物实验中心屏障动物实验设施进行【SYXK(辽)2013-0006】。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：L2014035)。

冰醋酸(天津市富宇精细化工有限公司，中国)，制成40%、50%、60%浓度冰醋酸；NaOH晶体(天津市富宇精细化工有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 化学灼烧法建立口腔溃疡模型

首先将50只SD大鼠按体重大小编号1～50，在统计分析软件中指定某一特定的种子数后产生对应的50个随机数，按随机数的大小顺序将50只大鼠均匀地分为5组，每组10只，分别以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定于操作台上，1～4组为下切牙牙槽骨唇侧黏膜(以下简称唇侧黏膜)处理组(图1 A)：用无菌棉球干燥SD大鼠唇侧黏膜，并用无菌棉球隔湿，后将3 mm × 3 mm正方形滤纸片分别置于40%、50%及60%浓度冰醋酸5 s后取出，立即放置于干燥后的唇侧黏膜上，或将3 mm × 3 mm的NaOH晶体置于唇侧黏膜，维持30 s后取下滤纸片或NaOH晶体，用含生理盐水无菌棉球蘸拭处理部位，去除残余醋酸或NaOH，观察记录处理部位即刻反应。第5组：采用50%浓度冰醋酸于SD大鼠单侧颊黏膜处建立溃疡模型(图1B)。二次灼烧组：对唇侧黏膜50%浓度冰醋酸处理组，待口腔溃疡愈合后，于原部位采用50%浓度冰醋酸再次处理30 s，观察同一部位二次化学烧灼法建立口腔溃疡模型的效果。

注: A.下切牙牙槽骨唇侧黏膜处理区；B. 颊侧黏膜处理区。图1 标准药物浸透滤纸片化学烧灼法建立口腔溃疡模型方法Note. (A) Lower labial gingival mucosa. (B) Buccal mucosa.Figure 1 Chemicals-soaked paper application for establishing an oral ulcer model in rats

1.2.2 肉眼观察

术后48 h，观察记录溃疡形成情况，包括形成溃疡的出现率、溃疡变化、外形是否均一规则、炎症充血情况，是否符合人类口腔溃疡的临床特征。观察记录溃疡愈合情况及愈合时间，愈合标准为黏膜上皮重新完全覆盖溃疡凹陷。

1.2.3 组织学观察

术后48 h，于每组随机选取两只形成溃疡的SD大鼠，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉后切取溃疡部位边缘组织，4%多聚甲醛固定液中固定48 h后，常规石蜡包埋，连续切片(7 μm)行HE染色，显微镜下观察每张切片溃疡部位视野的炎症细胞浸润情况、上皮及血管变化情况，是否符合人类口腔溃疡镜下特征。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同化学灼烧同一部位建立溃疡模型的出现率、肉眼观、愈合时间及镜下表现

不同化学灼烧形成溃疡模型的出现率及愈合时间的基本数据如表1，可以看出唇侧黏膜50%、60%浓度冰醋酸处理组建立溃疡的出现率100%(表1，图2 A)，与40%浓度冰醋酸组及NaOH处理组相比差异无显著性(P> 0.05)，说明不同化学灼烧建立溃疡的出现率并无太大差别，均可用于溃疡模型的建立。不同浓度冰醋酸处理组，唇侧黏膜即刻反应相似，肉眼观差异无显著性，皆表现为轻微发红，表面变粗糙。相比之下，NaOH处理组黏膜伤害较大，黏膜表面破溃出血，即刻形成不规则点状凹陷，周围黏膜发红。

唇侧黏膜化学烧灼法48 h后，各组皆有出现溃疡，其中不同浓度冰醋酸处理组均表现为中央凹陷、假膜覆盖、溃疡边缘红肿、刺激疼痛反应强烈。从溃疡形状看，50%浓度冰醋酸处理组溃疡基本均呈规则圆形，平均直径约为5～6 mm，而40%浓度冰醋酸组、60%浓度冰醋酸组形成的溃疡形状不均一，呈不规则圆形，直径分别约为4～5 mm和6～8 mm。NaOH处理组溃疡不规则，中央凹陷，直径约为8～10 mm，溃疡边缘红肿较为严重，刺激疼痛反应更为强烈(图2B)。

溃疡的愈合时间是药物治疗有效性的关键指标，根据表1我们进一步可以看出50%浓度冰醋酸处理组溃疡平均愈合时间与40%和60%浓度冰醋酸处理组相比差异无显著性(P> 0.05)，接近人类口腔溃疡愈合时间，但明显低于NaOH处理组(图2C)，差异均具有显著性(P< 0.05)。

化学烧灼法48 h后，HE染色示：40%、50%和60%冰醋酸处理的唇侧黏膜区镜下特点相似，表现为中央黏膜上皮脱落形成溃疡，表面炎性渗出物覆盖，周边黏膜上皮细胞内及细胞间水肿，毛细血管扩张、充血，血管内皮细胞肿胀，上皮内及血管周围有密集炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主(图2D)。40%、50%和60%冰醋酸处理的唇侧黏膜区溃疡愈合类似，肉眼观溃疡凹陷重新由黏膜上皮覆盖，黏膜表面光滑，黏膜颜色较周围黏膜稍偏浅，质地稍偏韧，有小面积瘢痕形成，约半月后溃疡部位黏膜颜色及质地恢复正常。NaOH处理组溃疡愈合后有较大面积瘢痕形成，溃疡区黏膜恢复正常需更长的时间。

表1 各组溃疡出现率与愈合时间对比Table 1 Comparison of ulcer formation rate and healing time of the

注： 出现率比较：50%a(lm)与二次灼烧相比P< 0.05，与其他组相比P> 0.05；愈合时间比较：50%a(lm)与40%a(lm)、60%a(lm)相比P> 0.05，与其他组相比P< 0.05。a，冰醋酸；lm，唇黏膜；bm，颊黏膜。

Note. Formation rate: 50% acetic acid lower labial gingival mucosa [a(lm)] group versus the second burn group (P< 0.05) and the other groups (P> 0.05). Healing time: 50% a(lm) group versus the 40% a(lm) and 60% a(lm) groups (P> 0.05) and the other groups (P< 0.05). bm, buccal mucosa.

注：A. NaOH、40%、50%和60%冰醋酸(a)处理唇侧黏膜的溃疡出现率；B. NaOH、40%、50%和60%冰醋酸处理48 h后溃疡区肉眼观；C. NaOH、40%、50%和60%冰醋酸处理后溃疡平均愈合时间；D. 50%冰醋酸处理48 h后溃疡区的组织学改变(左×10、右×40)，标尺=200 μm/50 μm。图2 不同化学灼烧法形成溃疡比较Note. Sodium hydroxide pellets, and 40%, 50%, and 60% acetic acid, were applied to the lower labial gingival mucosa of Sprague Dawley rats. (A) Ulcer formation rate. (B) Ulcer appearance after 48 h at the lower labial gingival mucosa. (C) Healing time. (D) Histological presentation of the ulcer area (HE stainning). Scale bars=200 μm, 50 μm.Figure 2 Comparison of the ulcer formation induced by different doses of chemicals

2.2 相同化学灼烧法不同部位建立溃疡模型的出现率、肉眼观、愈合时间及镜下特点

50%浓度冰醋酸处理颊黏膜溃疡出现率要比唇侧黏膜低，但两者相比其差异无显著性(P> 0.05)(见表1和图3 A)，说明50%浓度冰醋酸处理颊黏膜也可用于溃疡模型的建立。颊黏膜酸处理后即刻反应与唇侧黏膜相似，处理48 h后溃疡不规则，中央凹陷，假膜覆盖、溃疡边缘略红肿、刺激疼痛反应强烈，直径约为2.5～3 mm(图3B)。颊黏膜区域溃疡平均愈合时间高于50%浓度冰醋酸处理唇侧黏膜组，差异有显著性(P< 0.05)(表1和图3C)，颊黏膜溃疡组织镜下特点与唇侧黏膜溃疡类似，如前所述(图3D)。

2.3 二次化学灼烧法同一部位建立溃疡模型的出现率、肉眼观及愈合时间统计分析

唇侧黏膜二次化学灼烧法溃疡出现率极低(图4A)，与第一次相比，差异具有显著性(P< 0.05)(见表1)。即使形成溃疡，形状也不规则，溃疡面积较小(直径约为2 mm)，边缘黏膜略红肿，刺激疼痛反应轻微(图4B)，平均愈合时间仅4 d，与第一次相比差异具有显著性(P< 0.05)(表1和图4C)，说明该区域短时间内不适合连续建立溃疡模型。

3 讨论

动物模型是研究疾病病因、机制、转归及治疗等的重要方法和手段。国内外对口腔溃疡动物模型的建立也做了大量的研究、探究和论证[19]。免疫法诱导口腔溃疡动物模型的机理可能是特异性蛋白作为抗原进入机体，产生了特异性抗体从而引发口腔黏膜免疫反应。该方法的缺点是耗时长，方法较复杂，口腔溃疡出现的部位不固定，不适用于均一化的对照实验，但适用于研究复发性阿弗他溃疡发生、发展的机制。化疗法建立口腔溃疡动物模型的表现与临床接近，具有一定的代表性，但在口腔溃疡的发生部位、发生时间、动物选择、药物种类、给药剂量及途径等方面还要进一步摸索。氧自由基法诱导口腔溃疡动物模型的最大缺点是动物全身毒性反应较重，在给药剂量方面需根据不同动物而选择合适的剂量，在药物筛选实验时需适当扩大样本量。细菌感染诱导法建立口腔溃疡动物模型常用于口腔内细菌、真菌感染性疾病及抗菌药物评价的动物模型，不适合用于口腔溃疡治疗方法的研究[21]。

本实验溃疡模型的建立选用化学灼烧法，与其他方法相比具有试剂便取、方法简单、结果可控、操作安全的优点，且有采用NaOH和冰醋酸成功建立口腔溃疡的文献报道[8-11,18]。模型动物选用SD大鼠较兔更经济实惠，体型便于控制。在化学试剂的选用上，本实验表明冰醋酸较为温和，处理SD大鼠形成的口腔溃疡模型基本符合人类口腔溃疡的临床特征及病理特征，而NaOH处理后黏膜出血严重，伤害较大，且愈后形成瘢痕样组织较多，异于正常溃疡的愈合转归，可能是由于创伤过大而出现较重的创伤反应。我们的结果还证实40%浓度冰醋酸及60%浓度冰醋酸组溃疡模型欠规则，面积计算较为困难，不适合用于溃疡的治疗方法等疗效评价实验研究，而50%浓度是相对理想的浓度，形成的溃疡更规则，便于比较。40%浓度冰醋酸组溃疡形状不规则，可能与其浓度较低，受唾液的影响较大，对组织损伤较小有关；而60%浓度冰醋酸可能由于其浓度较高，处理过程中滤纸片上的冰醋酸更易扩散到周围黏膜组织，周围组织被灼伤形成溃疡而导致边界不规则。在处理部位上，本实验选用了靠近牙龈的角化黏膜和其下方的非角化黏膜组成的下切牙牙槽骨唇侧黏膜和由非角化黏膜组成颊黏膜。虽然人类口腔溃疡多发生于颊、舌等非角化黏膜上，但也可见于牙龈等角化黏膜上，其临床表现和病理表现相似，且发生于人类口腔不同部位溃疡的治疗方法并无太大差异，因此下切牙牙槽骨唇侧黏膜溃疡模型也可用于溃疡治疗方法的研究。且下切牙牙槽骨唇侧黏膜组相比于颊黏膜组具有溃疡形状规则，视野暴露佳，方便操作，视觉误差最小等优点，便于进一步实验测量溃疡面积、获取影像资料等操作。而颊黏膜形成的溃疡不规则可能与颊黏膜容易变形，暴露不佳等影响实验操作有关。

此外我们发现SD大鼠溃疡区愈合后短期再次使用冰醋酸处理，溃疡形成率极低，且形成的溃疡形态不规则，面积小，愈合时间短，肉眼可见有瘢痕样组织出现，原因不清，可能是由于溃疡愈合后短时间内该区形成的新组织耐受性较高，提示同一区域短期内不适合连续二次建立溃疡模型。

当然，化学烧灼造成的黏膜溃疡与临床复发性阿弗他溃疡的形成机制不同，该模型不适合用于复发性阿弗他溃疡的机制研究，但形成的溃疡表现类似，可用于治疗效果的评价。总之，本实验表明化学灼烧法建立口腔溃疡与试剂、部位及处理次数相关，溃疡模型的稳定性与试剂、部位及冰醋酸的浓度有关联，冰醋酸的浓度过高或过低均不能获得稳定的溃疡模型。SD大鼠下切牙牙槽骨唇侧黏膜处采用50%浓度冰醋酸处理30 s的方法获得的口腔溃疡，具有形状规则、愈合时间稳定及方便后续实验操作等优点，是用于评价口腔溃疡治疗效果的理想模型方案。