雪貂脂肪间充质干细胞的分离、分化与鉴定

石桂英，李珂雅，徐艳峰，韩云林，高舒平

(中国医学科学院医学实验动物研究所, 北京协和医学院卫生部人类疾病比较医学重点实验室 干细胞与临床转化实验室，北京 100021)

自从Zuk 等[1-2]从人体脂肪抽取物中成功分离出了具有多向分化潜能的间充质干细胞以来，脂肪干细胞(adipose derived stem cells, ADSCs)由于与骨髓间充质干细胞一样具有自我更新能力、血管再生潜能、免疫调节能力，可以在体外分离、扩增、诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等[3-6],已经是干细胞研究的热点。雪貂(Mustela pulourius furo)是食肉类动物，属于鼬科，作为新型的实验动物，由于他们的大脑功能和生殖生物学的生理特征以及各种疾病的特征愈加受到人们的重视和广泛的应用，目前已被应用于病毒学、生殖生理、药理学等研究。此外，雪貂对一些病毒性疫病具有独特的敏感性，已被常规用于人类流感病毒性疾病如H1N1及其疫苗方面的研究，还有诸如麻疹、疱疹性口炎、阿留申病、牛鼻气管炎及犬瘟热等模型研究；另有报道证明雪貂适合毒理学试验，还可作为小脑发育不全动物模型研究。近期，有文章报道雪貂可作为研究阻塞性呼吸道疾病的一个高度相关的模型[7]。王晓群等利用胚胎显微注射和CRISPR/Cas9技术，成功对雪貂胚胎进行基因编辑，得到了基因敲除雪貂，实验结果显示基因敲除雪貂与相关人类大脑疾病患者的表型十分相似，又为人类疾病的致病机理和治疗手段的研究提供了新的疾病模型[7]。雪貂有大量的脑白质和丰富的多脑回的特殊结构，它们可能是一种用于研究创伤性脑损伤的人类相关因素的理想的小型哺乳动物模型[8]。因此,分离和建立雪貂脂肪干细胞系，将会对干细胞的临床转化应用，进一步进行雪貂疾病模型的干细胞治疗评价奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

实验用雪貂来自于中国医学科学院医学实验动物研究所北方实验动物研究中【SCXK(京)2014-11】，雄性3只，雌性2只，24～36月龄，体重3～8 kg。动物实验取材在中国医学科学院医学实验动物研究所【SYXK(京)2011-0022】。动物实验方案经中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会批准，批准号为: BL17002。

1.1.2 实验试剂

胎牛血清(Gibco)，DMEM(Gibco)，PBS(Gibco)，青、链霉素原液(Hyclone公司) Trypsin-EDTA(Gibco BRL公司)，I型胶原酶(Sigma 公司)，成骨、成软骨、成脂诱导分化培养基均来自于Cyagen公司，Lamnin-111(Stemcell)，Forskolin(Sigma公司)，IBMX(Sigtrm公司)，β-FGF(Stem Cell)，EGF(Stem Cell)，B27(STEM CELL)，油红O(Amresco公司)；CD29-PE-cy7、CD45-Percp-cy5、CD90-FITC、CD105-APC 及CD11b-APC-Cy7 等单克隆流式抗体均为美国 Pharmingen 公司。

1.1.3 实验仪器

流式细胞仪(Aria Ⅱ，Becton Dickinson，美国)，荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 7300，美国)，电泳仪(北京六一仪器厂，中国)，CO2培养箱(Thermo，美国)，离心机(湘仪离心机有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 脂肪组织的提取与脂肪干细胞分离培养

氯胺酮麻醉处死雪貂后剪毛,碘酊、乙醇消毒，在无菌条件下于腹部做十字切口，皮下游离至腹股沟，采取腹部和腹股沟处皮下脂肪，在无菌条件下把脂肪组织剪碎成0.5 mm2的组织块，加入2倍体积容量的0.075%Ⅰ型胶原酶在37℃下振荡消化1 h，进行消化分离。经70 μm细胞筛过滤，4℃下1500 r/min离心10 min，弃上清。红细胞裂解液处理5 min，加入PBS，4℃下1500 r/min离心10 min，弃上清。以4000细胞/cm2的密度接种于培养瓶中。48 h后首次换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞。此后每3 d换液，观察细胞的形态变化。当细胞达到80%融合时，按1∶3 进行传代。

1.2.2 生长曲线的测定

采用MTT法，取P3，P4，P5 代对数生长期细胞，以 4000细胞/孔接种96孔板，分为4组，每组三个复孔，37℃，5% CO2 培养箱中培养。每隔 24 h 加入MTT溶液(5 mg/mL)，继续孵育 4 h，终止培养，吸弃培养上清液。每孔加 150 μL DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分融解。比色：选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.2.3 流式细胞术检测 ASCs表面特异性蛋白

取P3代脂肪干细胞，消化收集细胞，1000 r/min 离心5 min，2.5%FBS/PBS 溶液重悬后调整细胞浓度为106细胞/mL，向各样品管中分别加入标记的抗体，冰上避光孵育30 min，PBS 清洗3次后，流式细胞仪分析ASCs表面特异性抗原。标记的抗体有：CD29-PE-cy7、CD45-Percp-cy5、CD90-FITC、CD105-APC 及CD11b-APC-Cy7。

1.2.4 成脂分化及鉴定

选取生长状态良好的第3代细胞，以2×104细胞/cm2接种到6 孔培养板中，37℃，5% CO2培养箱中培养，当细胞密度达到50% ～70%，去除基质培养基，加入2 mL 成脂诱导培养基A(Cyagen)继续培养，3 d后换成脂诱导培养基B液(Cyagen)1 d, 共诱导14～21 d，观察诱导过程中细胞的形态变化，对照加入基质培养基。油 红O染色：吸去诱导液，用PBS洗2次；加入4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，加入去离子水清洗1次，加入60%异丙醇清洗2次。加入油 红O染色液，染色60 min； 用去离子水洗2次，去除残留的染色液； 加入PBS，完成染色；显微镜下观察,拍照。

1.2.5 成骨分化及鉴定

选取生长状态良好的第3代细胞，以2×104细胞/cm2接种到6 孔培养板中，24 h后更换为成骨诱导培养基(Cyagen)，每3 d换液，诱导周期为21 d。茜素红(Alizarin Red)染色: Tris-HCl配制0.1%茜素红溶液，其pH值调为4.2。吸去诱导液，用PBS洗2次； 加入4%多聚甲醛固定30 min；吸去固定液，加入0.1%的茜素红染色液，染色10 min；用PBS洗2次，去除残留的染色液；加入PBS，完成染色；显微镜下观察, 拍照。

1.2.6 3-D软骨分化及鉴定

选取生长状态良好的第3代细胞，按2×106细胞/ mL放置于1.5 mL Ependorf 管中，盖子用注射器针头穿刺小孔，保持管内能进入气体。离心后放置5% CO2，37℃培养箱培养12 h加入0.5 mL成软骨诱导培养液(Cyagen)，每3 d换液1次。培养第21天用4% 多聚甲醛固定，石蜡包埋，阿利新蓝染色，显微镜下观察并拍照。阿利新蓝染色：细胞球团用PBS清洗, 4%多聚甲醛固定10 min，再用20%的葡萄糖孵化30 min，移入OCT包埋剂中室温浸泡4 h，更换新的OCT包埋剂，室温浸泡6 h，将标本置于托物台，用恒冷箱切片机切片，片厚10 μm，贴于预处理的载玻片上，-20℃冰箱保存。冷冻切片用阿利辛蓝染色，反染色用核固红。石蜡包埋切片进行苏木素-伊红(HE)染色。

1.2.7 神经分化及鉴定

选取生长状态良好的第3代细胞，以3×104细胞/cm2接种于经Lamnin-111 包被处理的6孔板中，加入Neurobasal培养基(stem cell)，培养基内添加了0.5 mmol/L IBMX，10 μmol/L Foskolin, β-FGF(20 ng/mL)、EGF(20 ng/mL)、2% B27。每3 d更换新鲜诱导液，每周换液2次，每7～8 d传代1次。免疫荧光： ADSCs细胞以3000细胞 / cm2密度接种于预先用多聚赖氨酸包被处理的24孔板，孔中放置玻片,培养24 h后，加入神经诱导液进行诱导分化，诱导6 d后进行免疫荧光染色：先用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗1次，用0.5% Triton-X-100处理10 min，PBS洗1次，加入1% BSA封闭20 min，加一抗室温孵育1 h， PBS洗3次，加荧光二抗，室温孵育1 h，PBS洗3次。载玻片上先加1滴DAPI封片剂，将盖玻片从24孔板中移至载玻片上，用指甲油密封，用激光共焦显微镜拍摄荧光图像。

1.2.8 总RNA提取，cDNA合成和定量PCR分析

使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)从细胞中提取总RNA，总RNA浓度由260 nm(OD260)的光学密度测定。用Super ScriptTMIII First-Strand Synthesis System(Thermo Fisher)反转录成 cDNA，-20℃备用。应用SYBR® Premix Ex TaqTMII(Tli RNase H Plus)(Takara)反应体系检测相关基因如Nurr1、TH，每个样品用2 μL cDNA，加入10 μL Taq Mans Gene Expression Assay kit, 6 μL 无 RNase/DNase水，25 μL 2x Taq Mans Μniversal PCR Master Mix (Applied Bio-systems),总反应体系是 50 μL, GAPDH作内参。数据分析采用供应商提供的 ABI Prism 7000 Sequence Detection Systems version 1.0 软件系统，每个样本的Ct值用每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数来确定。每个目标基因的相对表达水平按照Taq Mans的管家基因GAPDH的Ct值来确定 (2△△Ct公式，Perkin Elmer 用户手册 #2)。每个样本一式三份进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 ADSCs的形态学观察，生长曲线，PCR干性基因检测

新分离的细胞是多种异质细胞的混合体，呈圆形，大小不一(图1 A)，悬浮于基质培养基中，培养24 h后可见梭形贴壁细胞，48 h首次换液后可见贴壁细胞开始呈现长梭形，多角形，至72 h 细胞数量明显增加，细胞排列密集，呈集落生长，约7 d细胞密度达80% ～90%。形态均一, 为长梭形(图1B), MTT测定生长曲线第3代至5代结果显示ADSCs增殖性能良好(图2)。干细胞干性基因和细胞结构关键基因PCR检测结果(图3)表明ADSCs表达干性基因Oct4，未表达胚胎干细胞的干性基因Nanog，Tert，Sox2；波形蛋白Vimentin负责维持细胞骨架的完整性，它对细胞的转分化具有重要作用。细胞表达基因CD13、CD45、CD59、CD105、CD166，表明所得细胞群是一个含有脂肪干细胞(ADSCs)、周细胞(pericytes)及内皮祖细胞(EPC)的混合体。

图3 半定量PCR检测干性基因结果(P1)Figure 3 Semi-quantitative PCR results for stemness genes (P1 cells)

图1 雪貂分离与传代后的细胞形态(P1)Figure 1 The morphology of passage 1 (P1) ferret ADSCs

图2 ADSCs增殖曲线Figure 2 Proliferation curve of the ferret ADSCs

2.2 ADSCs的表面抗原特征

细胞流式检测结果显示(图4)细胞均一性较好，第一代脂肪干细胞高度表达特征抗原CD90(53.1%)，CD105(93.7%)，CD29(99.6%)，低表达CD45(28.3%)，CD11b(36.3%)。结果表明分离获得的细胞符合间充质干细胞的基本特征。

2.3 诱导细胞的形态变化与特异性染色

成脂诱导过程中细胞形态发生明显变化，3 d后显微镜下可见部分细胞胞质中有细小的脂质颗粒出现，由纤维状细胞变成圆形细胞，并且细胞内有多个圆形空泡；第6天起，细小的颗粒汇聚成较大的脂滴；12 d后，分化成多脂滴或单脂滴脂肪细胞，14 d后，80%的细胞内充满脂滴，细胞核被挤向边缘，油红O染色结果，显示细胞中红染颗粒为脂滴(图5B)。细胞两端的突起缩短，细胞逐渐变圆。随着诱导天数的增加脂滴数量不断增多，油红O染色显示细胞内脂滴呈红色，对照组呈阴性(图5A)。

2.4 茜素红(Alizarn Red) 染色

更换成骨诱导培养基后，细胞生长快速，呈现鳞片状，并且连接成片，形成集落，随后细胞呈多层生长，胞质中出现丝状或颗粒状物质，胞外基质也不断增多，细胞表面钙盐沉积，诱导21 d后镜下观察，已无法分辨细胞形状，表面出现较多类似结节状的结构，茜素红染色后镜下可见细胞密集处有深红色沉着物，呈长岛屿状，并向四周放射，中心颜色明显加深，对照组无着色钙结节，实验组细胞外散在出现钙盐沉积, 21 d可见细胞外有大量钙结节出现(图6)。

2.5 成软骨分化

第三代的ASCs在成软骨诱导3-D分化21 d后，石蜡包埋切片，阿利新蓝染色可见蓝色的软骨胶原基质(图7)。

2.6 神经分化

用神经诱导液2 d后,细胞逐渐形成神经胶质细胞样细胞形态(图8), 6 d后的免疫荧光结果显示部分细胞表达神经前体细胞标记Vimentin，神经元树突标志物 Map2、NeuN(图9)，定量PCR检测到神经元标志基因TH、EN1、NURR1，以及CD44的升高(图10)。

图4 干性标志物细胞表面分子CD11b、CD45、CD29、CD90、CD105的流式检测结果Figure 4 FACS results for the stem stem cell surface markers CD11b, CD29, CD45, CD90, and CD105

图5 脂肪样细胞油红O染色(×200)Figure 5 Adipocyte-like cells,oil O staining(×200)

图6 成脂分化21 d后茜西红染色(×200)Figure 6 Alizarin red staining after 21 d of adipogenic differentiation of the ADSCs (×200)

注：A为对照组；B为实验组，软骨组织染成蓝色。图7 阿利新蓝与苏木素染色(×400)Note. A is for the control group. The experimental group is on the right (B) and cartilage dyed blue.Figure 7 Adipocyte-like cells,Alcian blue and hematoxylin staining(×400)

注：A为对照组，B为诱导3 d后。图8 雪貂ADSCs神经诱导分化对比Note. A.Control cells. B.3d after induction.Figure 8 Neural differentiation of ferret ADSCs

注：与对照组比较，* P< 0.05；与诱导组细胞比较，** P < 0.01。图9 实时定量PCR检测CD44、TH、EN1、NURR1基因表达Note. Compared with the control group, * P < 0.05. Compared with the induced cell group, ** P < 0.01.Figure 9 Real-time quantitative PCR results of the stemness gene CD44 and TH, EN1, and NURR1 expression

注：A，Map2(绿色×400)；B，NeuN(绿色×400)；C，Vimentin(绿色×630)。图10 雪貂神经分化6 d后的免疫荧光Note. A is Map2 (green ×400). B is NeuN (green ×400). C is Vimentin (green ×630)Figure 10 Immunofluorescence detection of the ferret ADSCs following 6 d of neural differentiation

3 讨论

雪貂作为新型的实验动物，愈加受到科学家的重视。由于脂肪间充质干细胞可以实现自体的干细胞移植，目前亦被认为是最有希望和应用前途的干细胞来源，它也是干细胞移植的理想的种子细胞。分离并鉴定雪貂脂肪间充质干细胞，为人类疾病的动物模型的干细胞治疗提供同源性的干细胞，并对干细胞安全性、有效性评价提供依据具。此外，雪貂在病毒性疾病及神经系统疾病的研究及疫苗的开发应用中可能具有重要价值。目前，分离和应用雪貂的间充质干细胞国内外尚未见报道，由于目前市场上尚没有雪貂的专用抗体，我们采用了大鼠的抗体，结果表明大鼠的抗体与雪貂有同源性也有不同，比如CD11b与CD45在理论上应该是阴性的即小于5%，而CD90仅仅表达了53.1%，理论上表达应该在95%以上，但是整体阳性抗体的高表达与阴性抗体的低表达的基本趋势符合间充质干细胞的特点。成软骨分化我们采用了较为先进的3-D诱导方法即用细胞球进行的成软骨分化方法。最近的文献报道显示与传统贴壁培养的间充质干细胞相比，3-D 培养的细胞球在抗凋亡、多向分化、旁分泌、抗炎等多项生物功能上明显增强，其机制与细胞骨架的改变、细胞接触的增加和低氧微环境的刺激有关，在动物实验中对于难愈性创面的修复、缺血组织的修复、组织重塑具有显著治疗效果，有广阔临床应用前景[9]。ASCS成神经分化目前在大、小鼠中虽然有报道，但是尚未见雪貂脂肪干细胞分化为神经元的报道，我们也还需要对分化的神经元做进一步的细胞膜电位测试并证实其具有分泌功能性神经元的功能。神经分化培养液中采用的神经诱导剂IBMX (3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)，是胞内cAMP降解酶磷酸二酯酶(PDE) 的非特异性抑制剂, 它可以通过抑制细胞内环磷酸腺苷的降解而提高胞内cAMP水平，而第二信使cAMP 对细胞的增殖和细胞的多种功能有重要的作用，细胞内的cAMP水平增加有助于体外的细胞分化[10]。