溶菌酶1在小鼠超数排卵前后孵化及休眠囊胚中差异表达的研究

卢文瑾，郭勇，胡新宇，张寅屏，黄启震，刘迪，王力红，田凤，盛熙晖，齐晓龙，邢凯，倪和民，王相国*

(1. 北京农学院动物科学技术学院，北京 102206； 2. 厦门大学医学院生殖调控与生殖健康研究福建省高校重点实验室，厦门 361102； 3. 中山大学附属口腔医院·口腔医学研究所，广州 510030； 4. 北京市昌平区畜牧水产推广站，北京 102200)

哺乳动物胚胎的着床以及发育过程一直是生殖领域研究的热点，胚胎在发育过程中受多种激素、生长因子以及各种酶的影响。早在20世纪60年代，科学家就发现，哺乳动物胚胎发育到囊胚阶段存在不立即着床的现象，这种现象使动物的交配和妊娠的时间得以延长，从而最大限度地保证后代在适宜的环境里出生并成长[1]。胚胎发育到胚泡阶段时暂时进入休眠状态而并不立即着床的现象称为延迟着床，处于延迟着床状态的胚胎又称休眠囊胚，此时胚胎在子宫中代谢速度变缓，停留时间延长。大鼠、小鼠、雪貂以及有袋动物均存在延迟着床现象。此外，无脊椎动物、植物、昆虫也存在延迟着床现象[2]。研究者在蝙蝠中发现，虽然群体中母蝙蝠交配时间不尽相同，但群体中大部分雌性蝙蝠能保证同时分娩，让幼崽在同一时间出生，这种同步化现象能扩大幼崽种群，保证种群的存活率，大大减少幼崽的死亡率，对于种群来说是进化优势的体现[3]。

溶菌酶1(lysozyme 1，LYZ1)是存在于哺乳动物体液中的一种小分子碱性酶，广泛存在于哺乳动物的血液以及肝中，眼泪、尿液、唾液和乳汁中也有分布；在黏膜表面，其浓度可达到1 mg/mL；在巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突状细胞等专业吞噬细胞中也有分布[4]。溶菌酶家族中所有成员都具有水解细菌细胞壁肽聚糖的能力，并且总体结构相似。LYZ1是体液免疫中最为关键的第一道防御系统中的重要组成成分，对革兰阳性菌以及部分革兰阴性菌都有杀灭作用。细菌细胞壁的主要成分肽聚糖，是N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸交织形成的多糖支架，他们之间依靠β-1,4-糖苷键相互交联，N-乙酰胞壁酸分子上接四肽侧链，肽链再相互连结，形成的网状结构成为支撑细菌细胞的基础。LYZ1专一作用于多糖支架之间的β-1,4-糖苷键，细菌细胞壁将失去支撑作用，从而使细菌溶解，人及哺乳动物不含细胞壁，故溶菌酶对人体无毒害作用[5]。目前溶菌酶已被运用于多种研究领域，在食品行业可用做防腐剂，或去除酒中的沉淀[6]；在医疗行业常与其他抗菌药物一起使用治疗细菌感染；由于溶菌酶只对细胞壁有破坏作用，在生物工程行业上也常用于原生质体的制备。但在生殖方面的功能少见报道，研究证实，处于延迟着床状态的囊胚不含有透明带，比正常孵化囊胚具有更强的抗逆性。本实验室前期研究结果证明：经过程序化冷冻的小鼠休眠囊胚解冻后存活率显著高于正常孵化囊胚，显示经历冷冻过程的休眠囊胚具有更好的抗冻潜力，而实验室前期基因表达谱[7]结果发现：程序化冷冻处理前、后休眠胚胎中Apol8[8]基因在表达水平显著差异，RhoA[9]、Hba-α[10]、C3[11]等基因与正常孵化囊胚相比也有差异。与此类似，前人在冷冻、超排以及休眠三个因素对小鼠胚胎差异表达基因进行分析，发现LYZ1基因在超排前后和休眠胚胎表达有明显差异。

因此，研究LYZ1及其家族在生殖领域的作用潜力能进一步为阐明胚胎发育过程提供新的依据。本试验通过研究超排和休眠因素对LYZ1蛋白在小鼠休眠囊胚与正常孵化囊胚中分布的影响，分析休眠囊胚具有更强发育潜力的原因，挖掘LYZ1基因在小鼠囊胚阶段的潜在作用，探索哺乳动物胚胎着床过程中新的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级的性成熟ICR品系雌性小鼠50只，平均体重25～30 g，8～11周龄；SPF级的性成熟ICR品系雄性小鼠25只，平均体重35～40 g，9～12周龄，均来源于北京维通利华动物科技有限公司【SCXK(京)2014-0008】，试验操作在北京农学院屏障动物实验室内进行【SYXK(京)2015-0004】。

1.1.2 实验试剂

芝麻油、孕酮购自Sigma，美国；兔抗LYZ1单克隆抗体，购自Abcam，货号：ab108508；抗兔LYZ1抗体，购自Cell Signaling，货号：7074P2；PMSG、hCG购自宁波三生有限公司；TBST (pH8.0，10 ×)，购自康为世纪，货号：CW0043S；PVDF膜，购自索莱宝。

1.1.3 实验仪器

光学显微镜，江南仪器厂；电子天平，Sartorius，BS124S，美国；显微镜BX51，Olympus，日本；盖玻片、载玻片，江苏世泰实验器材有限公司；低温高速离心机，Beckman Allegra Centrifuge 64R，美国；掌心离心机，Bratt，美国；超净工作台，上海智城分析仪器，ZHJH-1112B；激光共聚焦显微镜，Olympus，日本；脱色摇床，Qilinbeier TS-1000；凝胶成像仪，BIO-RAD，美国。

1.2 实验方法

实验分为4组：A为不超排-孵化；B为超排-孵化；C为不超排-休眠；D为超排-休眠。

1.2.1 超排处理

选择阴门潮红、处于发情期的雌鼠，于晚间18:00腹腔注射PMSG 0.1 mL(10 IU/只)，间隔46～48 h后，腹腔注射hCG 0.1 mL(10 IU/只)，注射后立即合笼(公母比为1∶1)，次日上午08:00点之前检查阴道栓，检出阴道栓雌鼠用于获取超排孵化囊胚和超排休眠胚胎，将此天记为胎龄第1天(day 1)。

1.2.2 孵化囊胚的获取

于见栓第5天(day 5)上午08:00颈椎脱臼法处死见栓雌鼠，摘取母鼠双侧子宫，除去系膜，使用PBS工作液多次冲洗双侧子宫角收集囊胚，经PBS洗涤3次，储存在-80℃保存备用。见栓第4天(day 4)上午08:00麻醉见栓雌鼠，将雌鼠双侧卵巢从背部摘除，保留输卵管并缝合，此后，每天早晨08:00于小鼠颈部皮下注射0.1 mL孕酮(0.2 mg/mL)，连用3 d，在次日上午(day 8)08:00冲洗双侧子宫收集休眠胚胎。回收的胚胎经PBS洗涤3次，储存在-80℃冰箱备用。

1.2.3 休眠胚胎的获取

见栓第4天(day 4)上午08:00麻醉见栓雌鼠，摘除雌鼠双侧卵巢，小心操作以保留输卵管，随后连续3 d早晨08:00在小鼠颈部皮下浓度为0.1 mL孕酮(0.2 mg/mL)，次日上午(day 8)08:00用PBS工作液冲洗双侧子宫收集休眠胚胎。回收的胚胎经PBS洗涤3次，储存在-80℃冰箱备用。

1.2.4 共聚焦显微镜术检测LYZ1蛋白在各组胚胎上的分布

①固定：胚胎于PBS中充分洗涤，此后，室温条件下置于4%多聚甲醛中固定30 min；②清洗：固定后的胚胎置于0.1% BSA-PBS液滴中室温清洗6次，每次8 min；③通透：清洗后的胚胎室温条件下置于2.5% Tween 20-PBS中通透5 min；④清洗：用0.1% BSA-PBS洗涤6次，每次8 min；⑤LYZ1抗体孵育：4℃条件下，胚胎置于LYZ1抗体(1∶2000)中过夜孵育；⑥清洗：先后采用0.2% Triton X-100，0.1% BSA-PBS各清洗6 次，每次8 min；⑦二抗孵育：37℃条件下，胚胎在置于稀释好的抗LYZ1抗体荧光二抗(1∶1500)中避光孵育1.5 h；⑧清洗：先后采用0.2% Triton X-100，0.1% BSA-PBS各清洗6次，每次8 min；⑨染核：将胚胎置于PI染核液中染核5 min，再将胚胎置于0.1% BSA-PBS液滴中洗去染核液，重复3次，每次10 min；⑩压片：洗净后将胚胎置于在载玻片中央，用少量凡士林支撑起盖玻片四角，在轻轻盖上盖玻片，缓慢操作，以免将胚胎挤压变形；封片：盖玻片四周用透明快干指甲油封住，在暗室条件下，尽快放入Confocal显微镜中成像。

1.2.5 LYZ1蛋白在各组胚胎间差异表达变化

①从-80℃冰箱中将冻存有胚胎的离心管取出，置于冰上，每100枚胚胎中加入10 μL裂解液，短时涡旋震荡后，冰上孵育30 min，充分使其裂解；②12 000 r/min，4℃离心5 min，获取上清液，等体积加入2× protein loading buffer；③沸水浴5 min，待冷却备用；④配制浓度为12% SDS-PAGE分离胶，15% SDS-PAGE浓缩胶，室温静止，待凝胶凝聚后上样，电泳1.5 h，电泳结束后转移蛋白至PVDF膜上；⑤室温条件下，将PVDF膜完全浸入封闭液中，摇床封闭2 h；⑥4oC条件下，将PVDF膜置于LYZ1抗体(1∶1500)中过夜孵育；⑦用1×TBST洗涤未结合到膜上的抗体，3次，10 min/次；⑧37oC条件下，将PVDF膜转移至抗LYZ1抗体的荧光二抗(1∶1000)中摇床孵育1.5 h；⑨孵育后用1×TBST洗去未结合到PVDF膜上的荧光二抗；⑩ECL化学显色后，凝胶成像仪成像。

1.2.6 图像分析

用Image J软件对凝胶成像系统所得图片进行灰度分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 孵化囊胚和休眠囊胚形态结构观察

孵化囊胚与休眠囊胚均已完全孵化，无透明带(图1a和1b)。从图1中可以看出，两种胚胎内细胞团和滋养外胚层细胞结构完整，边缘清晰，可用于后续实验。

图1 小鼠休眠囊胚和孵化囊胚(bar=80 μm)Figure 1 Dormant and hatched mouse blastocysts (scale bar: 80 μm)

2.2 LYZ1蛋白在超数排卵前后孵化囊胚和休眠胚胎中的分布情况

LYZ1蛋白在超排前后的小鼠孵化囊胚和休眠胚胎中的滋养层细胞和内细胞团中均有分布，但进行超数排卵过程后的休眠胚胎中的LYZ1蛋白明显集中于内细胞团中。见图2。

2.3 LYZ1蛋白在超数排卵前后孵化囊胚和休眠胚胎中的差异表达分析

各组胚胎蛋白中看家基因β-actin表达稳定，可用于后续实验。用Image J软件对凝胶成像系统图片进行灰度值分析(见图3a)。SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析，结果如图3b所示：超数排卵前后的小鼠正常孵化囊胚和休眠胚胎均能检测到LYZ1蛋白的表达；且超排前后孵化囊胚(A组、B组)中LYZ1蛋白表达差异无显著性(P>0.05)；而超排-休眠囊胚(D组)LYZ1蛋白表达差异极显著高于超排-孵化组(B组)和不超排-休眠的囊胚(C组)；同时休眠后的不超排囊胚(C组)与休眠前不超排孵化囊胚(A组)相比，差异无显著性(P>0.05)。

注：A.不超排-孵化囊胚；B.超排-孵化囊胚；C.不超排-休眠囊胚；D.超排-休眠囊胚。绿色荧光表示LYZ1蛋白分布区域；红色荧光表示细胞核。图2 LYZ1蛋白在各组胚胎中分布情况Note: A) Hatched blastocysts, no superovulation; B) hatched blastocysts, superovulation; C) dormant blastocysts, no superovulation; D) dormant blastocysts, superovulation. Green fluorescence represents LYZ1 protein, and red fluorescence represents nuclei.Figure 2 Localization of LYZ1 protein in the embryos of each group

注：a. Western Blot 检测LYZ1蛋白在各组胚胎间的相对表达量。b. Western Blot检测LYZ1蛋白相对表达量分析图: A.不超排-孵化囊胚；B.超排-孵化囊胚；C.不超排-休眠囊胚；D.不超排-休眠囊胚。上标相同字母表示差异无显著性(P>0.05)；不同字母表示差异有极显著性(P<0.01)。图3 LYZ1 蛋白在各组胚胎中差异表达分析Note: a. Western blot analysis of relative LYZ1 protein expression in the embryos; b. western blot analysis of relative LYZ1 expression in: A. hatched blastocysts, no superovulation; B. hatched blastocysts, superovulation; C. dormant blastocysts, no superovulation; and D.dormant blastocysts, superovulation. The same letterindicates no significance (P>0.05), while different letters indicate significance (P<0.01).Figure 3 Differential expression analysis of LYZ1 protein in the embryos of each group

3 讨论

广泛分布于体液中的溶菌酶作为免疫反应中的重要成员参与了体内多种免疫反应，其水解细菌细胞壁的出色能力赋予了溶菌酶在非特异性免疫中的重要地位。它可改善和增强巨噬细胞吞噬消化功能，识别细菌脂多糖，灭杀细菌，增强机体抵抗力，由于水解作用的专一性，细菌很少对溶菌酶产生抗性。有报道显示，经放射线照射后的家兔血清中溶菌酶含量呈现下降趋势[12]，因此血清中溶菌酶的含量或可作为衡量机体放射损伤的一项指标来反映机体的损伤程度[13]。

与正常孵化囊胚相比，休眠囊胚细胞的代谢率低，与周围环境的能量交换过程较少。滞育期间，胚胎细胞将进入一种维持自身较低的能量及代谢的状态。正常孵化囊胚经历短暂“窗口期”就会着床，与母体子宫建立紧密联系。而胚胎滞育期间，子宫不具有容受性，经过微量雌激素刺激，胚胎才会开始着床，因此相比于能量代谢旺盛、与母体子宫发生信息与物质联结的正常孵化囊胚相比，休眠囊胚能更好的抵抗外界各种刺激。这与本研究发现的LYZ1蛋白在超排后休眠囊胚中的表达显著高于孵化囊胚基本一致。

蛋白表达定位结果显示，LYZ1蛋白在四组胚胎的内细胞团中均有表达，而休眠囊胚中表达量明显高于孵化囊胚，说明LYZ1蛋白在早期胚胎发育过程中具有重要作用，并且主要在内细胞团内发挥作用以维持细胞的稳定状态。蛋白相对表达水平结果研究表明，超排后休眠囊胚中LYZ1蛋白的表达极显著上调，说明休眠囊胚与正常孵化囊胚在抵御不利环境下的机制有很大不同。LYZ1为保护胚胎免受外界影响而在此时上调，高水平LYZ1蛋白可能有利于胚胎在相对不利条件下存活，维持细胞内稳态。超排-孵化组的LYZ1蛋白在滋养层细胞中有分布，其余三组的LYZ1蛋白主要集中在内细胞团中表达。而内细胞团比滋养层细胞具有更少的线粒体，所以其能量代谢水平比滋养层细胞更低，所以在内细胞团细胞中自噬活动较少，细胞能量代谢处于静止状态[14]。Lee等[15]发现，小鼠滋养层细胞中的自噬比内细胞团中的高。LYZ1在胚胎内细胞团和滋养层细胞中的广泛分布，是胚胎在面对不利环境时提高存活能力的表现，这也是休眠囊胚抗逆性强于正常孵化囊胚的另一种体现。

胚胎休眠期间，有许多基因和蛋白在休眠时期有差异表达[16]。然而，尽管休眠小鼠囊胚中的DNA合成和有丝分裂停止，代谢率下降，但仍满足了胚胎存活的最低营养需要[17]。造成此差异的原因是在滞育期间小鼠胚胎提供代谢需求的机制与孵化囊胚有很大不同[18]。有证据表明，延长的休眠周期与休眠胚胎的数量呈负相关[14]，雌激素停药后激活自噬，诱发延迟着床，而自噬在休眠囊胚延长存活的过程中持续存在。Weitlauf[18]发现延迟着床的胚胎再激活时，虽然细胞整体自噬总体水平并无下降，但内细胞团中的自噬体数量有下降的趋势。延迟着床期间，细胞能通过自噬作用溶解少量细胞，被消化成碎片的细胞可以作为胚胎细胞中重要的营养物质被溶酶体-高尔基体消化，重新循环合成滞育期间需要的蛋白质。溶菌酶也是一种溶酶体酶，自噬发生时，自噬小泡与溶酶体将融合形成自噬吞噬体，从而影响溶菌酶的分泌过程。Starling[14]认为自噬途径分泌溶菌酶是由内质网应激引发的。很可能当体内稳态受到干扰，蛋白质运输、分拣系统出现压力或应激时，溶菌酶将进入自噬运转系统，被双层囊泡结构包裹着运输至相应部位参与调节。

Sae-Kwang等[19]在对小鼠构建败血症模型后，发现术后第5天，患败血症小鼠全部死亡，但对患病鼠体内注射溶菌酶5 d后能将小鼠存活率提高到20% ～30%。这是因为在机体发生炎症反应时，血管内皮蛋白C受体(EPCR)会脱落成为可溶性的血管内皮蛋白C受体(s EPCR)，而s EPCR是血管受损的标志之一，脱落的EPCR刺激体内免疫系统，引起炎症反应，而血管上皮中的溶菌酶能抑制血管内皮蛋白C受体的脱落，表明溶菌酶在炎症反应发生时能维持血管完整性。2012年，Kaizu等[20]用RNA干扰技术造成溶菌酶在对虾体内缺失，以此分析溶菌酶在对虾体内的功能。结果显示，缺失溶菌酶的对虾在5 d内全部死亡，死亡原因是对虾淋巴中的血细胞数量大量减少和体内细菌数量显著增加。Lapcharoen对感染疟原虫的按蚊进行了溶菌酶基因敲除实验[21]，结果显示敲除该基因后，疟原虫卵囊数量显著减少。原因是当疟原虫入侵按蚊体内，激活了按蚊的先天性免疫防御反应，按蚊肠上皮会分泌出一些蛋白酶和表面蛋白，其中就含有溶菌酶，这些蛋白经过一系列复杂的级联反应，最终生成黑色素和毒性物质，此过程称为黑化包被反应，按蚊通过此机制抵御和消灭入侵体内的疟原虫[22]。这些都显示出溶菌酶在胚胎发育过程中是至关重要的，缺失将会导致生物致死或对寄生虫卵囊发育产生消极影响，在遭遇不利条件时又能上调使机体维持稳态。

在小鼠孵化囊胚中，LYZ1蛋白少量分布在整个透明带滋养层细胞中，在孵化和休眠囊胚中，LYZ1集中分主要分布在胚胎细胞的内细胞团中。发育至囊胚阶段的胚胎，在经历短暂的“窗口期”后进行胚胎着床，在母-胎进行营养与物质交换的胎盘中，以及乳汁中均含有溶菌酶，预示从孵化囊胚时期开始，LYZ1已在胚胎发育过程中发挥一定的作用。囊胚的休眠过程延长了囊胚在子宫隐窝中停留的时间，子宫外环境和胚胎自身主动调节代谢速度变缓，来保证胚胎存活，胚胎代谢减缓到能维持其生存的最低水平，在这种情况下，母体子宫的免疫系统调动一系列激素与酶参与休眠过程，以此保证胚胎的正常代谢和存活。

目前LYZ1的功能研究主要集中在免疫系统和非特异性免疫中，本研究发现其在胚胎发育中同样有着至关重要的作用。由此可见，LYZ1基因对于囊胚在超数排卵和休眠双重因素下有着不可忽视的作用。下一步研究将继续检测LYZ1在小鼠不同妊娠阶段的表达以及分布，将有助于进一步了解LYZ1在胚胎不同发育阶段的分布和功能，能更完整地诠释该基因在生殖方面的功能。