单分子荧光共振能量转移用于生物大分子构象动态变化过程研究进展

孙乐乐 苏莹莹 高延静 李威 吕慧 李宾 李迪

摘 要 生物大分子参与生命活动的各个过程，在单分子水平上实时观测和分析生物大分子自身的结构动态以及生物大分子相互作用的动态过程，对于深入理解生物大分子的作用机制具有重要意义。自提出以来，单分子荧光共振能量转移技术逐渐展现出其在研究生物大分子构象变化和相互作用过程等方面的巨大潜力，一系列新的作用机理陆续被提出。本文对单分子荧光共振能量转移技术在蛋白质与核酸分子构象动态变化、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质-核酸相互作用等方面取得的研究进展进行了综述。

关键词 单分子荧光共振能量转移； 生物大分子； 构象动态； 相互作用； 评述

1 引 言

细胞生命活动各个过程都离不开蛋白质、核酸等生物大分子。研究生物大分子的作用机制对于理解基本生物学过程至关重要，然而普通的生物学研究手段无法实时观测生物大分子发挥作用时的状态变化，只能间接地观测宏观现象，然后对过程机制进行推断。依据宏观现象推出的作用机理只能在一定程度上帮助人们认识生物过程，生物分子究竟如何发挥作用，必须有微观的证据才更有说服力，例如ATP合成酶的作用机制、G蛋白偶联受体如何传递信号等，都是在取得单分子水平上的证据后才得到更加深入的认识[1～3]。对于宏观系综研究， 单分子研究的最大优势是可以直接观测到单个生物分子发挥作用时的构象动态或生物分子间相互作用时分子间距离的变化[4～8]，获取的机制更加接近真实情况。此外，单分子水平的研究能夠揭示生物分子之间的个体差异[9]，有助于全面深入地认识生物分子的功能性质。

目前，在单分子水平研究生物分子构象变化或生物分子相互作用动态过程的技术有光镊[10]、 磁镊[11，12]、原子力显微镜[13～16]及单分子荧光技术[17～21]。光镊和磁镊技术要求高，操作难度大，无法进行高通量研究；原子力显微镜的成像时间分辨率低，因此在单分子研究方面应用不多。单分子荧光技术起源于20世纪90年代[17]，目前已经逐渐成熟地被用于生物学领域，并出现多个分支，其中单分子荧光共振能量转移技术（SM-FRET）被广泛用于生物分子相互作用的研究[22]。单分子荧光共振能量转移技术是指能够观测单个生物分子上荧光供体和受体之间共振能量转移的技术[23]，具有以下优势：（1）荧光共振能量转移的原理使其能够观测到生物大分子发挥功能时不同结构域或亚基之间空间位置的变化，或者分子之间相对距离的变化[23]，这些变化对于直接理解生物分子的作用机制十分重要； （2）目前全内反射荧光显微镜广泛应用于SM-FRET研究，其利用激光全反射产生的隐逝波进行照明，具有极高的信噪比，能够观测到界面上单个荧光分子；同时利用高速的制冷型电荷耦合器件（CCD）进行成像，时间分辨率可以达到亚毫秒水平。该高时间分辨率对于实时观测快速的相互作用或构象变化过程至关重要[24]； （3）光学成像允许同时对多个目标进行观测，高通量观测便于比对被研究对象个体之间的差异； （4）成熟的基因工程技术和化学修饰方法使得研究者能够对蛋白质或核酸分子进行定点荧光标记[25～28]，同时，丰富的界面封闭和目标物固定方法可以保证观测的特异性[23]。自1996年，基于SM-FRET技术的研究取得了一系列成果[29]。本文将围绕单分子荧光共振能量转移技术在蛋白分子自身构象动态变化[30～38]、蛋白质-蛋白质动态相互作用[6，7，39]、核酸分子自身构象动态变化[40～47]以及蛋白质-核酸动态相互作用[48～62]等方面取得的一些代表性研究成果进行综述。

2 单分子荧光共振能量转移技术

荧光共振能量转移现象是供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的激发光谱相重叠，且两个分子间距离小于10 nm时，供体的激发能诱发受体发出荧光，同时供体自身的荧光强度减弱的现象，在生物学研究中常被用于鉴定两种蛋白质之间是否发生相互作用。SM-FRET技术是观测单个生物分子上荧光供体和受体之间共振能量转移。目前，SM-FRET实验中最常用的成像仪器是全内反射荧光显微镜（TIRFM），包括棱镜型和物镜型两类（图1A）[63]。商业化的TIRFM多为物镜型，这是因为物镜型TIRFM激发光和荧光都经过物镜，样品台有更大的操作空间，能够更好的与其它设备联用，如显微操作设备。除了设备，SM-FRET实验最关键的是研究对象的定点荧光标记以及对象在界面上的特异性固定。核酸定点标记比较容易，蛋白定点标记则要依赖基因工程手段，还要保证标记的位点不影响蛋白结构。将研究对象特异性地固定在石英片或盖玻片表面，对于观测实验十分重要，目前常用的方式是用聚乙二醇（PEG）封闭玻璃表面，然后通过抗体或生物素-亲和素进行固定（图1B）[63]。SM-FRET实验中获得的数据是荧光供体和受体分子荧光强度随时间的变化的轨迹，然后通过表观FRET效率方程计算出对应的FRET效率随时间变化的轨迹（图1C）[63]，进而对FRET效率进行统计分析，以获得变化规律。

3 单分子荧光共振能量转移技术用于生物大分子构象和相互作用动态研究

3.1 单分子荧光共振能量转移技术研究蛋白分子构象动态

蛋白质分子的折叠和构象动态变化直接关系到其自身功能，研究蛋白质折叠过程和构象动态变化，有助于理解蛋白分子形成功能结构及发挥功能的机理。1999年，Ha等[30]首次将SM-FRET应用于单个葡萄球菌核酸酶（Staphylococcal nuclease，SNase）分子的结构动态研究。他们将荧光供体（Tetramethylrhodamine，TMR）和荧光受体（Cy5）修饰到SNase的两个特定位点上，通过观测分析单个SNase上TMR和Cy5的荧光共振能量转移效率，发现SNase分子之间存在不同的构象波动模式，这归因于蛋白骨架结构或侧链在毫秒级时间范围内的波动。同时，他们通过观测分子间的荧光共振能量转移获得了SNase与单个底物DNA分子之间的动态相互作用信息。该研究为后续研究单个蛋白分子结构动态以及蛋白折叠提供了新思路。

利用示综研究手段研究非均相反应动力学中的波动，以及相关的酶结构的变化行为，复杂反应中非同步的性质等十分困难[9]。Chen等[31]研究了T4溶菌酶在催化大肠杆菌的细胞壁水解反应时的结构变化信息。他们在酶的两个互不干扰位点特异性地修饰荧光供体-受体分子对，通过分析供体和受体分子荧光强度随时间的变化信息可以得到酶的铰链弯曲行为，发现每个酶分子的催化反应的速率常数之间存在较大的差异性。

包含未折叠或弱折叠域的天然无序蛋白（Intrinsically disordered proteins，IDPs）在细胞信号转导过程中发挥重要作用，IκBα是IDPs的典型代表[64]。研究表明， IκBα可通过其不稳定的锚蛋白重复区（Ankyrin repeat 5-6，AR5-6）结合并调控转录因子NFκB的功能[65]，但是难以获得关于AR5-6结构动态信息。Lamboy等[32]通过SM-FRET研究发现，自然态的IκBα的结构并不是固定不变的（图2A），长时间的观测结果表明IκBα可以在紧密的折叠态和松弛的不稳定态之间发生转换，但后者是主要状态（图2B）。另外，在结合NFκB后，IκBα的结构波动受到抑制（图2C）。IDPs的不稳定区结构波动较大，适合用SM-FRET进行观测，因此SM-FRET还被用于研究其它与疾病相关的IDPs，如α-Synuclein[66] 和 p53[67]，这些研究取得了传统手段无法获取的单分子动态信息，加深了对IDPs的理解。

3.2 单分子荧光共振能量转移技术研究蛋白质-蛋白质动态相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用普遍存在于生命活动的各个过程，包括细胞信号转导、细胞骨架结构形成等[70，71]。细胞膜表面受体响应配体信号发生聚集的过程对于有些受体活化是必须的，了解基于蛋白质-蛋白质相互作用的受体-配体复合物形成过程对于研究信号如何传递十分重要。Sako等[7]将SM-FRET和单分子追踪（Single-molecular tracking，SMT）技术结合，实时检测荧光修饰的表皮生长因子（EGF）与其受体（EGF-EGFR）的结合过程和EGF-EGFR复合物的聚合过程（图3A）。他们通过对获取的单分子轨迹进行统计分析，发现一个EGF分子首先和一个EGFR二聚体结合成复合物，然后直接结合第二个EGF分子。他们推测EGFR二聚体在结合第二个EGF之前已经形成了二聚体，进而通过SM-FRET实验直接证明了EGF-EGFR二聚体的形成（图3B）。

原核和真核生物经常利用能在细胞的质膜形成孔道的毒蛋白（Pore-forming toxins，PFTs）来杀死其它细胞，在细菌毒性方面发挥重要作用[72]。PFTs的形成一般是多个水溶性的前体蛋白单体结合到细胞膜上，然后前体蛋白发生构象变化进而相互结合组装成孔道[73]。了解孔道形成的过程机制有助于理论研究和相关药物研发，但是由于孔道形成过程中涉及多种动力学中间体，传统方法难以对整个过程进行研究。Nguyen等[6]首次利用SM-FRET研究了红细胞膜表面γ溶血素的协同自组装过程。金黄色葡萄球菌杀白细胞素快速组分（LukF）和γ溶血素第二组分（HS）是组成细胞膜表面γ溶血素的两个部分，他们在前体蛋白LukF和HS的特异位点上分别修饰TMR（荧光供体）和IC5（荧光受体），通过观测和分析红细胞膜上两种前体蛋白的FRET信号及受体单独的荧光信号，统计出每个低聚物的亚基的数量。他们推测在单体和细胞膜结合、低聚物成孔以及最后形成孔团簇的的自组装途径中，存在多种低聚物中间体。通过检测序列中间态的结合平衡常数发现，整个过程大概包含有11个序列平衡常数，存在3种协同聚合状态，分别是二聚和二聚体的相互聚合、单孔的自组装以及孔的聚合。这种将单分子荧光共振能量转移的方法应用在单分子层面上对蛋白聚合中间体的观察和分析，为研究細胞膜表面蛋白的动态相互作用过程开辟了新的途径。2015年，Benke等[74]将SM-FRET和微流控技术、双聚焦荧光相关光谱和停-流圆二色等结合，详细研究了另一种孔道形成毒蛋白（Bacterial cytolytic toxin ClyA）的组装机制（图3C）。他们在每一个单体上修饰荧光供体（A488）和受体（A594），通过FRET效率及其它表征，提出了孔道形成的过程模型并推导出相关的动力学参数（图3C）。该研究也说明，将SM-FRET和其它新技术结合起来可以深入研究许多生物学问题。最近，有研究者提出用多色SM-FRET研究多种蛋白之间的动态相互作用过程[39]。

3.3 单分子荧光共振能量转移技术研究核酸分子构象动态变化过程

核酸最基本的功能是作为生物体的遗传信息载体，部分核酸分子还具有催化功能和调控功能[75]，直接观测核酸分子的构象动态有助于理解核酸发挥功能的机制。霍利迪连接体（Holliday junction）是基因重组过程中的重要中间体[76]，尽管传统的动力学研究方法可以预测到霍利迪连接体能在两种堆积异构体之间进行转换，但是由于无法测得同步转变过程，动力学数据以及结构的动态信息无法获得。McKinney等[41]在霍利迪连接体的两端修饰荧光供体Cy3和受体Cy5（图4A），首次直接观测到单个霍利迪连接体在两种构象之间进行转变，发现霍利迪连接体构象转变的速率和DNA的序列﹑抗衡离子的种类﹑温度等相关。同时他们获得的动力学信息提示霍利迪连接体的堆积构象转变和其分支的迁移存在联系。该研究首次展示了SM-FRET在研究DNA结构动态方面的巨大潜力。Joo等[77]利用SM-FRET技术发现了霍利迪连接体中少见的结构种类以及离子对连接体的影响。 随后，2005年，McKinney等[78]又观察到了霍利迪连接体一步步自发地分支迁移的过程。很多生物过程包括基因重组都存在张力，为了能够研究霍利迪连接体这个对力敏感的结构在外力作用下的纳米级微小变化，Hohng等将SM-FRET和光镊技术相结合来观测霍利迪连接体受到不同方向的拉伸力时的构象变化[40]。如图4B所示，霍利迪连接体的一端连在界面上，另一端通过一个长双链DNA和磁珠连接，通过改变霍利迪连接体与长双链DNA连接的位置可以在3个不同方向上施加< pN 的力（图4C）。通过分析力的作用下霍利迪连接体上荧光对的FRET效率，分析霍利迪连接体构象转变的中间态，这与之前只能观测到构象转变的终态相比是一个重大突破。

核酶（Ribozyme）是一类具有催化功能的核酸（DNA或RNA），其中RNA核酶相比于DNA核酶，种类和功能更加丰富，包括化学键的连接﹑结构的折叠﹑以及催化等功能[75，79]。这些功能发挥的过程中表现出多种动力学途径和过渡态，利用单分子荧光技术研究这些复杂的过程能更直观地得到每个RNA分子的结构分布状态以及实时的结构变化信息，进而更准确地对其动力学特征等进行分析[79]。1999年，Ha等[42]首次利用SM-FRET研究核糖体中RNA分子的结构变化。他们利用FRET效率的变化研究发现核糖体蛋白S15和Mg2+作用对三螺旋交联的RNA分子构象分布影响很大，尤其是Mg2+处于中间浓度时构象表现出反常分布，这些构象变化与核糖体功能直接相关。Nahas等[80]研究了发卡RNA核酶的催化过程，发现发卡RNA核糖酶的裂解动力学和键合动力学完全不同。另外，SM-FRET技术也使他们能够在同一个分子上观察到裂解和结合的多次循环，从而检测到RNA分子在不同状态之间转换的速率。2007年，Hee等研究了金属依赖的单个DNA核酶的折叠和催化性质[43]，发现Zn2+和Mg2+可以引导DNA核酶折叠成更紧凑的结构，以进行催化裂解反应。但是，当Pb2+作为辅助因子时，DNA核酶则不需要提前折叠。

RNA是如何折叠成为天然结构状态的的过程对于研究RNA的功能特征十分重要，但是对RNA折叠过程的研究却大大落后于蛋白折叠的研究，这主要是因为RNA的势能图比较复杂，对RNA折叠过渡态进行表征更加困难[81]。Bokinsky等[81]利用SM-FRET实验，实时检测发卡核酶在不同结构状态之间的平衡转换。如图4D所示，研究模型是WTAC5发卡结构的RNA核酶，他们用FRET荧光基团对发卡结构的两端进行标记，并在其中一端的不同链上修饰生物素，通过这种方法使其可以固定在界面上，以便更好地进行单分子观测。研究发现，金属阳离子的加入，可以使RNA核酶的发卡结构发生改变，荧光对之间的FRET效率也会发生改变。另外，随着周围温度的改变，RNA核酶在两种状态之间转换的速率也会发生改变，他们还总结出了两种状态之间的自由能图谱（图4E）。Wilson等[82]同样利用单分子荧光共振能量转移技术研究了离子介导的RNA核酶折叠，在核酶结构环的附近加入中间体后，其折叠速率提高500倍。Brenner等[83]研究了鸟嘌呤在核糖开关结构中的作用，为RNA调控基因表达提供了一个模型。最近，Uhm等[44]还利用SM-FRET研究了大肠杆菌硫胺素焦磷酸盐核糖开关的共转录折叠动态，Manz等[45]研究了S-腺苷甲硫氨酸核糖开关的能级。

3.4 单分子荧光共振能量转移技术研究蛋白质-核酸动态相互作用

DNA复制＼＼遗传信息转录和翻译等重要生物过程都存在蛋白与核酸的动态相互作用。解旋酶在DNA复制过程中发挥重要作用，它可以利用ATP水解产生的能量解开DNA双螺旋，很多疾病与之相关[84]。 2002年，Ha等[48]利用SM-FRET技术首次实时观测了大肠杆菌解旋酶打开DNA双链的启动和重启过程。他们在有单链伸出的双链一端修饰荧光供体和受体（图5A），通过FRET效率监测解旋过程（图5B）。结果表明，解旋酶的单体可以利用水解ATP产生的能量朝向单双链连接处运动，但是解旋需要形成完整的解旋酶；而且解旋过程会暂时中断和重新启动，这可能是由于解旋酶暂时脱离DNA然后又重新结合到DNA上开始工作。 Myong等[50]通过SM-FRET观测发现，大肠杆菌解旋酶可以在DNA上面重复穿梭，能够清楚地看到每一个单体可以利用ATP水解产生的能量在单链DNA上面发生移动。解旋酶在DNA上迁移的过程中会驱动DNA结合蛋白从DNA上解离，但是其中的机制难以说明；另外，解旋酶迁移时的步幅也未得到证明。2010年，Park等[85]以PcrA解旋酶为对象进行SM-FRET观测实验，发现PcrA解旋酶會优先在滞后链上移位，并使滞后链发生卷曲，形成高度重复的环形单链，这种结构的形成使他们推测出PcrA解旋酶移位的步幅是一个核苷酸，同时使DNA发生卷曲要求PcrA解旋酶具有更开放的构象，这种构象可以快速除去结合在DNA上的RecA蛋白。

DNA复制过程中双螺旋被打开后容易发生损伤， 修复损伤的过程中RecA蛋白扮演重要角色[86]。之前的研究[87]表明，RecA可与单链DNA结合形成螺旋形核酸-蛋白纤维，这种纤维促进了基于同源重组的损伤修复，但是RecA与DNA结合的动态过程难以观测。2006年，Joo等建立了一种基于SM-FRET的方法，能够实时观测单个RecA蛋白与DNA结合和解离的过程（图5C）[49]。利用基于隐马尔科夫模型的分析方法，他们首次获得了RecA纤维生长的动力学信息（图5D）。RecA蛋白催化同源重组的一个重要步骤是寻找同源双链DNA， Ragunathan等利用基于SM-FRET的高时空分辨率成像方法对此过程进行了观测[88]。他们的实验结果支持了RecA蛋白纤维进行同源检索的滑动模型，即RecA蛋白纤维会沿着双链DNA进行扩散运动，这种滑动模式可以使检索同源双链DNA的速度提高200倍。

核糖体在细胞中负责将mRNA携带的信息翻译成蛋白，是由蛋白质和RNA构成的复合体[89]。实时观测核糖体蛋白和RNA的组装过程有助于理解核糖体功能结构的形成。细菌的30S核糖体由21种蛋白在一条16S rRNA（核糖体RNA）通过层级组装构成[89]，其中核糖体蛋白S16 对于30S核糖体的后续组装步骤十分关键，一个重要问题是前期蛋白的组装对后续蛋白组装的影响[51]。 2017年，Abeysirigunawardena等[51]利用三色SM-FRET研究了结合在16S的5'区域的核糖体蛋白S4﹑S17和S20促进下一个蛋白（S16）进入复合物的过程。如图5E所示，他们在16S rRNA的螺旋3（Helix 3）上标记Cy7，S4蛋白上标记Cy5，S16、S17和S20蛋白上标记Cy3，通过Cy5-Cy7和Cy3-Cy5的FRET信号监测复合物的形成过程（图5F）。他们发现S4和S20蛋白，而不是S4和S17蛋白，结合到16S rRNA后可以促进S16蛋白的加入。S17和S20都能稳定16S 5'区域的螺旋连接结构，但是只有S20可以使16S rRNA的构象能够稳定S16蛋白的加入。S16结合到16S rRNA上后，16S rRNA的结构趋于松散，促进了30S核糖体后续组装过程。

近年來，CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛用于生命科学研究。 2016年，Singh等[57]首次用SE-FRET实时观测了RNA指导的核酸内切酶识别靶标DNA的过程。最近，有研究者利用SM-FRET 研究了CRISPR/Cas9系统中I-E型检测复合物如何快速找到靶标以及Cas9切割DNA时的构象动态[52，53，56]。

4 总结与展望

单分子荧光共振能量转移技术已被成功用于研究许多重要的生物学过程，并取得了一些突破性的进展， 但也有其自身的局限，如基于荧光分子间距离变化的共振能量转移信号只能提供被标记位点之间的距离变化信息，但是无法测量两个位点沿着怎样的轨迹产生距离变化，这种信息对于理解生物过程也很重要。未来可能需要发展单分子多色荧光共振能量转移，同时结合晶体学数据和理论模拟进行数据分析，以解决上述问题。单分子荧光共振能量转移技术的另一个局限是无法测得生物过程的力学信息，这可能需要更多地与单分子操纵技术（如光镊、磁镊等）结合进行研究。单分子荧光共振能量转移技术是学科交叉产生的技术，其自身的逐渐完善，以及更多地与其它技术联合，必然可解决更多生物难题。

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Abstract Biomacromolecules participate in various kinds of vital processes. Observing and analyzing their structural dynamic and the dynamic processes of intermolecular interaction at molecular level is important for understanding the action mechanism. Since its advent， single molecular fluorescence resonance energy transfer （SM-FRET） has demonstrated its great potential in studying the conformational change and interaction process of biomacromolecules， and a series of new mechanisms have been revealed. This review summarized recent progresses of SM-FRET in studying protein structural dynamic， nucleic acid structural dynamic， protein-protein and protein-nucleic acid interactions.

Keywords Single molecular fluorescence resonance energy transfer； Biomacromolecule； Structural dynamic； Interaction； Review

（Received 1 March 2018； accepted 3 April 2018）