大鼠心脏移植物排斥反应时心肌瞬时外向钾电流与心肌细胞动作电位变化的研究

贾一新 孟 旭 焦玉清 韩 薇 李 岩 罗文琦 王宏娟

心脏移植(heart transplantation,HTx)是治疗终末期心脏病的有效方法。排斥反应(acute rejection,AR)是影响HTx近远期疗效的重要因素[1-2]。早期诊断和治疗AR是心脏移植患者长期存活的重要保障。利用心电生理发现和诊断排斥反应已经有较多的研究：排斥反应发生时，心室电压减低[3-4],心肌阻抗增加[5]，静息电位降低[6]，心肌内心电图(intramyocardial electrograms, IMEG)QRS波幅降低，心室刺激反应的T波降支最大斜率(the maximum slope of the descending T wave of the ventricular evoked response，VER T slope)降低[7]等。这些研究揭示了排斥反应发生时，心肌细胞电生理信息的改变，但其中的机制并不清楚。动作电位(action potential，AP)的形态和时长反应了心肌细胞受到刺激后的电生理特性，而瞬时外向钾电流(transient outward potassium current，Ito)是AP复极I期的主要成分，Ito电流密度及动力学特征的改变可以显著地改变心肌的电生理特征,间接影响其后其它电流的激活和失活过程,对动作电位的时程和形态有较大影响[8-9]。目前已有研究证实，在许多心血管疾病中表现出Ito电流和通道表达的改变，然而，在心脏移植排斥反应中AP与Ito电流密度的变化并不清楚，以及其与上述排斥反应心电生理特征是否相关也未有研究，因此，本研究以大鼠异位心脏移植模型为样本，拟研究心脏移植物排斥反应时心肌细胞AP与Ito电流密度的变化。

资料与方法

1.实验动物 雄性,8周龄,Brown Norway(BN)大鼠,共60只，体质量230g左右；雄性8周龄,Lewis大鼠,20只，体质量230g左右。40只,BN大鼠作为供体，20只BN大鼠和20只Lewis大鼠作为受体。所有动物由首都医科大学附属北京安贞医院动物室提供并喂养，遵循动物福利原则，并得到伦理委员会批准。

2.异位心脏移植 采用改良大鼠腹部心脏移植动物模型手术方法[10-11]。心脏移植物冷缺血时间<45m。每日经腹部触摸检查移植心脏存活情况，如有移植物丢失，再进行补充，确保研究组例数。

3.实验分组 对照组与实验组各20只，均分为四组，每组5只。四组动物分别在移植后第2、4天处死，迅速获取心脏移植物，一组行病理检查，一组行电生理检查。

4.病理检查 于术后第2、4天，处死各亚组大鼠，获取移植心脏。以苏木素-伊红(HE)染色，参考ISHLT排斥反应分级方法[12]，在光镜下以半定量评分的方式评估移植心脏心肌细胞损伤和炎症细胞侵润情况[13-14]。ISHLT grade 0记为0分； ISHLT grade 1A记为1分； ISHLT grade 1B记为2分；ISHLT grade 2记为3分； ISHLT grade 3A记为4分； ISHLT grade 3B记为5分； ISHLT grade 4记为6分。

5.电生理检查 (1)移植物心室肌细胞制备 取出供心，离体心脏放入盛有4℃ Buffer B的10cm小皿中，清洗心脏，迅速去除脂肪和心包膜，游离主动脉，剪开右心房。打开恒流泵，主动脉逆行插管连于Langendorff灌流装置(图1)上，心脏内血液清除干净后改为Buffer A灌流，继而酶液灌流。心室肌组织剪成尽量小的组织块，用吸管轻轻吹打，使细胞从心肌碎块上分离，获得单个心室肌细胞。细胞复钙完成，膜片钳实验中选择杆状，外形完整，透光度好，横纹清晰无颗粒的细胞进行实验研究(图2)。

(2)全细胞膜片钳记录 实验在室温(20～25℃)下进行，细胞孵育0.5h后将小皿中的上清液缓慢倒出，分别加入相应的细胞外液，同时要配合使用对应的电极内液。小皿固定于倒置显微镜载物台上，固定浴液电极。尽量减低噪音的干扰。显微镜下选取外形完整，形状规则，边缘整齐，表面光滑无颗粒，横纹清晰，无收缩的长杆状细胞。设定到电流钳模式给与一定时间和强度的电流描记各细胞组全细胞动作电位的变化。设定到电压钳模式给与一定时间和强度的电压刺激描记各细胞组钾、钠、钙等通道电流的变化。膜片钳放大器系统通过A/D和D/A数据转换器与计算机进行连接，PatchMaster软件控制相关的刺激信号以及电流、电压信号的采集(图3)。玻璃微电极拉制仪拉制玻璃毛胚成尖端直径1～1.5μm的玻璃微电极。打开监测窗口，出现测试脉冲电流方波信号(图4)。充灌好电极内液的玻璃微电极正压入水，电阻为4～5ΜΩ，电极接触细胞前补偿液接电位。用三维操纵仪调节电极尖端的位置使其移向细胞表面，轻压细胞微变形，1mL注射器负压吸引封接心肌细胞，形成高阻封接(Giga seal)，封接电阻1GΩ以上,脉冲信号消失，完成封接，进行电极电容补偿。观察1～2min，如果不能自行破膜，1mL注射器负压吸引。漏电流提示失败，退出玻璃微电极，退出前先解除微电极管内负压状态。若破膜成功，则会出现充放电现象，形成全细胞的记录模式，此时要对全细胞膜电容进行补偿。补偿完成后给与相应的电信号刺激，进行信号采集。信号经四阶贝塞尔的低通滤波器，截止频率为1kHz，采样频率为10kHz。

图1 Langendorff灌流装置的示意图；图2 分离得到的大鼠移植心脏心室肌的细胞

图3 全细胞膜片钳记录示意图；图4 玻璃微电极负压吸引封接心肌细胞

(3)记录方法 钳制模式：将PatchMaster膜片钳系统Recording Mode调至Whole Cell模式，封接破膜后给予相应的电压刺激，记录细胞的钾、钠和钙离子通道电流；同样的方法封接破膜后，将Recording Mode调至C-Clamp模式，I-membrane数值设为0，给予相应的电流刺激，记录细胞的动作电位。

1)瞬时外向钾电流 记录Ito时细胞外液中加入CdCl20.1mmol/L以阻断钙电流，加入CdCl21mmol/L以阻断钙激活氯电流。

记录Ito的I-V曲线时Vh为-90mV，先给予一个50ms至-40mV的去极化刺激以灭活INa。Vt从-40mV开始，以10mV阶跃刺激至60mV，时程400ms，采样频率10kHz。以测试电压60mV的Ito峰值电流密度在用药后的变化作为观察指标。

记录Ito稳态失活的刺激方案：维持电压-90mV，给予300ms从-120mV至60mV阶跃10mV的前刺激，然后测试电压钳制在60mV 300ms记录Ito电流，并比较用药后变化。

记录Ito失活后时间依赖性恢复的刺激程序：采用双脉冲刺激，维持电压-90mV，继而先后给予两个去极化到60mV持续200ms的去极化刺激P1、P2，其时间间隔Δt依次增大分别设为1，5,10,15,20,25，30,35，40,45,50,55，60,65,70,75,80,85，90(ms)。记录P2对应的峰电流I。以I/Imax对Δt做出稳态失活后恢复曲线。

2)内向整流钾电流 记录Ik1时，在细胞外液中加入CdCl20.1mmol/L以阻断钙电流。记录Ik1的I-V曲线的刺激方案为Vh-80mV，Vt从-150mV开始，以10mV阶跃刺激至 10mV，钳制时间400ms，采样频率2kHz。

3)动作电位 采用电流钳方式。形成高阻封接并破膜后，给予5ms，以100pA阶跃，自100pA阶跃至3nA的电流刺激，频率为20kHz，其后以2nA，5ms的电刺激观测动作电位电压的变化。

6.统计学方法 本实验获得的原始电流数据均采用PatchMaster及Igor软件进行分析和测量，使用GraphPad Prism 5对测量后的数据进行拟合和作图。采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。计量数据以均数±标准差表示，组间比较应用非配对t检验或方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1．动物模型建立结果见表1。

表1 动物模型建立结

2．术后第2天、第4天对照组移植心脏HE染色检查，未发现明显的炎症细胞浸润，无心肌细胞坏死(图5～8)。术后第2天，实验组移植心脏组织学检查可见血管周围和间质内淋巴细胞浆细胞浸润，排斥反应半定量评分(1.75±0.5)分。术后第4天，实验组移植心脏组织学检查可见广泛的炎症细胞浸润，并可见灶性及多灶性心肌细胞坏死，排斥反应半定量评分(4.2±0.45)分(图9～12)。

图5～6 对照组大鼠移植术后第2天移植心脏HE染色；图7～8：对照组大鼠移植术后第4天移植心脏HE染色

图9～10 实验组术后第2天，移植心脏组织学检查，可见血管周围和间质内淋巴细胞浆细胞浸润；图11～12：实验组术 后第4天，移植心脏组织学检查，可见广泛的炎症细胞浸润，并可见灶性及多灶性心肌细胞坏死

3.瞬时外向钾电流 移植术后第2天，两组心室肌细胞的Ito密度在-40～60mV测试电压下差异无统计学意义；术后第4天，与对照组比较，在各测试电压下实验组移植心脏心室肌细胞Ito密度均显著下降(P<0.05,表2～3，图13)。

表2 术后第2天两组Ito密度

表3 术后第4天两组Ito密度

4.内向整流钾电流 移植术后第2天，两组心室肌细胞的Ik1密度在-150～ 50mV测试电压下差异无统计学意义，术后第4天，与同基因组比较，在-150～-60mV、60mV测试电压下同种异基因组移植心脏心室肌细胞Ik1密度显著下降(P<0.05，表4～5，图14～15)。

图13 大鼠移植心脏心室肌细胞瞬时外向钾电流的电流密度-电压曲线图 A:移植术后第2天；B:移植后第4天

图14 移植后第2天心室肌细胞IK-1电流电流密度-电压曲线图;图15 移植后第4天心室肌细胞IK-1电流密度-电压曲线图

APD/ms移植后第2天移植后第4天同基因组同种异基因组P值同基因组同种异基因组P值APD5011.33±1.85721.46±2.5160.013616.00±2.68719.17±1.7770.3272APD9049.28±5.62188.08±6.4450.001659.34±5.183104.0±9.5230.0064

表4 术后第2天两组Ik1密度

5.动作电位 移植术后第2天，与对照组比较，实验组移植心脏心室肌细胞动作电位时程显著延长[APD50分别为(11.33±1.857)vs. (21.46±2.516)，P=0.0136；APD90分别为(49.28±5.621)vs. (88.08±6.445)，P=0.0016]。移植术后第4天，实验组心脏心室肌细胞动作电位时程显著延长[APD90分别为(59.34±5.183)vs. (104.0±9.523)，P=0.0064](表6)。

表5 术后第4天两组Ik1密度

讨 论

动作电位是细胞处于兴奋状态的标志，实验显示心肌细胞动作电位在同种异基因大鼠腹部心脏移植术后显著延长，提示心肌细胞动作电位的延长可能是心肌细胞电生理改变的基本电生理机制。Ito是动作电位发生时的第一个复极电流[15]，在心肌细胞去极化时快速激活、失活，形成动作电位快速复极1期和平台2期起始部[16]。Ito具有电压、时间及频率依赖性，其大小决定了动作电位1相的电位幅度，其活性还影响了电压门控钙通道的激活和平台期内向电流与外向电流的平衡，从而介导了复极2期的波幅及持续时间。在大鼠、犬及人类，Ito是控制心室肌细胞动作电位时程的主要电流。在病理情况下，Ito大小、生理特性发生改变，导致心室肌Ito跨室壁的电压梯度发生变化，导致了心肌复极化的改变，诱导心肌电重构，从而导致心脏电生理学特性的变化。目前已有研究证实，在许多心血管疾病中表现出Ito电流和通道表达的改变。心肌缺血时，由于缺血缺氧心肌局部代谢产物的堆积，正常的微环境发生变化，如 pH 值下降等。研究发现心室肌细胞膜上的Ito在缺血、缺氧、pH值改变时明显地受到抑制，这可能是心肌梗死后Ito电流密度降低的诱因。体外试验亦证实缺氧环境、pH值的微小变化均会使心肌细胞的Ito明显减低，进而影响心肌 APD和心肌细胞内信号转导。我们实验发现，与同基因大鼠移植心脏心室肌细胞相比，异基因大鼠心脏移植术后第4天，Ito密度显著降低，与实验发现的动作电位时程延长一致，因此推测在心脏移植术后急性排斥反应时，心室肌细胞动作电位时程的延长与Ito的降低有密切关系。有研究证实，Ito通过影响ICa,L、ICa,NCX来调节心肌的兴奋收缩偶联[17-19]。因此，Ito在心脏移植排斥反应时的变化最终导致了心脏收缩、舒张功能的受损。同时本实验还发现同种异基因组大鼠心室肌细胞内向整流钾电流(Ik1)在术后第4天显著降低，Ik1是决定工作心肌细胞膜静息电位的主要离子流，在动作电位3相快速复极化过程中起着重要作用[20]。这种电流的特点是膜电位负于静息电位时，表现为钾离子内流，当细胞膜轻度去极化时钾离子外流，而进一步去极化时，钾离子外流反而减少甚至消失，具有明显的内向整流性质，所以被命名为内向整流钾电流，其典型的I-V曲线成“N”形。Ik1的降低可导致细胞膜3相复极化速率减慢，使得动作电位时程延长。

我们实验发现在同种异基因组大鼠心脏移植术后第2天动作电位幅度显著延长，而Ito、Ik1变化均不明显，这说明可能还存在其他的因素影响动作电位。为明确动作电位在心脏移植排斥反应时的变化，尚需进一步的实验研究。深入了解心肌细胞电生理变化机制，可进一步提高心脏移植急性排斥反应的诊断和治疗。

本实验的局限在于我们仅研究了排斥反应心脏移植物心室肌细胞的AP、Ito和Ik1，另外还有其他与一些离子通道影响动作电位时程，如Ca2+电流，也会影响动作电位时程，在心脏排斥反应发生时，Ca2+电流或其他离子电流是否影响动作电位的时程和形态，尚需进一步的实验研究。