关于异型南五味子总三萜对类风湿关节炎大鼠抗炎靶点干预的研究

【摘 要】目的：探討异型南五味子总三萜对类风湿关节炎的抗炎效果、抗炎靶点和药物的作用机理。方法：将造模成功的胶原诱导性关节炎（CIA）大鼠100只随机分为模型对照组，甲氨蝶呤组，南五味子高、中、低剂量组，每组20只。通过观察CIA大鼠不同时间足趾肿胀容积程度，血清免疫球蛋白M（IgM）、IgM2RF、γ-干扰素（IFN-γ）水平改变，大鼠关节滑膜基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、MMP-3表达情况。结果：在改善CIA大鼠足趾肿胀容积方面，甲氨蝶呤组、南五味子各剂量组12，15，30 d与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01）；给药15，30 d，南五味子高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意

义（P > 0.05）。大鼠血清中IgM、IgM2RF、IFN-γ含量比较，南五味子高、中剂量组较模型对照组均有显著抑制作用（P < 0.01），且高剂量组较甲氨蝶呤组对IgM、IgM2RF抑制差异有统计学意义（P < 0.01），低剂量组这3个指标有降低的趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。在大鼠关节滑膜组织MMPs表达中，异型南五味子高、中、低剂量组均能显著抑制该蛋白高表达，与模型对照组和甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：异型南五味子各剂量对类风湿关节炎急性炎症期大鼠组织肿胀疼痛均有显著的缓解作用，且对炎性模型血清炎性细胞免疫因子和组织滑膜致炎蛋白酶有抑制效果，据此推测该药可能是通过阻断MMPs高表达抑制炎性因子及病情进展。

【关键词】 关节炎，类风湿；异型南五味子；抗炎；基质金属蛋白酶；组织滑膜液；大鼠

Study on the Interference of Total Triterpenes of Heterogenous Schisandra on Anti-Inflammatory Target

in Rats with Rheumatoid Arthritis

Deng Ming

【ABSTRACT】Objective：Discuss the anti-inflammatory effect and target of total three terpenes of fructus schisandrae chinensis on rheumatoid arthritis，and to infer the possible mechanism of the drug.Methods：

One hundred CIA rats were randomLy divided into 5 groups，including model control group，methotrexate group，and South Schisandra group（high，medium，and low dose），20 rats in each group.The degree of swelling volume of the toes at different times after inflammation was observed.Serum IgM，IgMRF，IFN-γ level changes，CIA rat synovial MMP-1，MMP-3 expression of anti-triterpenoids and total anti-triterpenoids.Results：In improving the swelling volume of the CIA rat toes，the difference was statistically significant between 12，15，30 d

in each dose group and model control group（P < 0.01）.There was no significant difference between 15，30 d in the high dose group of South Schisandra and the methotrexate group（P > 0.05）.For the comparison of IgM，IgMRF，and IFN-γ in rats serum，the high and medium dose of Schisandra were significantly inhibited compared with the model control group（P < 0.01），and the

high dose group compared with the methotrexate group was significantly（P < 0.01）.while the low dose group had a decrease in these three indicators，but there was no statistical difference（P > 0.05）.In the expression of MMPs in rat joint synovial tissue，the high expression of the protein was significantly inhibited in the three groups of South Schisandra，which was statistically significant compared with the model control group and the methotrexate group（P < 0.05）.Conclusion：Different dose groups of special-shaped South Schisandra had significant effects on the swelling and pain in acute inflammatory stage of rheumatoid arthritis，It also has inhibitory effect on inflammatory cytoimmune factor and synovial protease in serum of inflammatory model.It is assumed that the drug maybe by blocking the high expression inhibition factor of MMPs to achieve the progress of inhibition.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；heterotype south schisandra；inflammatory；matrix metalloproteinase；tissue synovial fluid；rats

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性结缔组织病，是免疫系统异常引起的多关节滑膜炎症、增生，进而血管翳生成、骨质破坏，造成关节畸形和功能障碍[1]。我国RA发病率呈逐渐增高趋势，未经过正规治疗的患者致残率高，病死率是一般人群的1.5～1.6倍[2]。因其难以根治、病程长、并发症多、致残率高等[3]，给患者及家属带来沉重的精神和经济負担。目前临床上治疗本病常用的部分西药和中成药长期服用后容易出现骨质疏松、胃肠道刺激等不良反应，且大多数患者需要多种药物联合使用才能控制病情，因此更加重药物相互的不良反应，研发低毒性、高效能的植物类抗风湿药物成为新的研究方向。异型南五味子总三萜是广州中医药大学深圳医院多年研究的民间常用的特色药物，在前期研究中发现该药对动物模型有较好的镇痛效果[4]，以及较少的不良反应[5]，本研究继续观察该药物对RA的抗炎效果以及作用靶点，现将结果总结报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物 清洁级健康SD大鼠130只，其中雌性65只，体质量（120±25）g，雄性65只，体质量（118±23）g。动物来源为广州中医药大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK-（粤）2016-0001。所有大鼠在实验前均常规驯养1周，正常进食进水，自由活动，动物房温度和湿度分别保持在20 ℃和70%。

1.2 实验药物 由广州中医药大学深圳医院制剂室提供，异型南五味子藤茎采于粤北山区，采用蒸馏提纯浓缩法制成提取物总三萜浸膏备用，药液浓度与原药材比重为1∶2。

1.3 主要仪器及材料 DHP9272电热恒温培养箱（深圳右一仪器公司）；实验全自动酶标仪（上海拜格生物有限公司）；牛Ⅱ型胶原（北京柏雷德生物公司）；大鼠免疫球蛋白M（IgM）、IgM2RF、γ-干扰素（IFN-γ）、基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、MMP-3试剂盒（上海轩辕医疗科技有限公司）；甲氨蝶呤片（上海上药信谊药厂有限公司，生产批号036171101，规格2.5 mg）。

1.4 造模和分组 选取120只SD大鼠按照造模方法建造CIA模型，再取10只为正常对照组。造模方法参照文献[6]：将溶于醋酸的牛Ⅱ型胶原2 mg·mL-1与完全弗式佐剂1∶1等比混合成乳液，冰浴下充分乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂。每只受试大鼠尾巴根部皮下注射上述乳剂0.1 mL，3周后再按上法注射1次，建立CIA模型。正常对照组按照等体积生理盐水注射。采用关节炎指数（AI）作为判断标准：0分为正常，1分为趾关节稍有肿胀，

2分为趾关节及足趾关节肿胀，3分为踝关节以下足爪肿胀，4分为包括踝关节在内足爪全部肿胀且严重变形。AI值等于四肢关节肿胀积分和，> 4分表示造模成功。本实验造模成功率是85%。正常对照组作为关节炎指数参照（0分标准）。

成功造模后取100只大鼠依照随机数字表法分为模型对照组，甲氨蝶呤组，南五味子高、中、低剂量组，每组20只，雌雄各半。

1.5 给药方法 上述5组按照固定剂量灌胃给药，其中模型对照组灌服质量分数为0.9%的生理盐水1 mL·kg-1·d-1，甲氨蝶呤组灌服甲氨蝶呤片

0.9 mg·kg-1，每周1次，南五味子高、中、低剂量组分别灌服南五味子提取物总三萜浸膏

6 mg·kg-1·d-1、3 mg·kg-1·d-1、1 mg·kg-1·d-1，

持续30 d，自由饮水和喂食物。

1.6 观察指标 观察并记录各组CIA大鼠给药后0，12，15，30 d的足趾肿胀容积变化情况，末次给药后在大鼠腹主动脉采血，采用ELISA法检测各组大鼠血清中IgM、IgM2RF、IFN-γ、MMP-1、MMP-3水平。处死大鼠，并取大鼠双后足炎性踝关节，用中性甲醛溶液固定，脱钙，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后脱蜡脱水，苏木依细胞核染色封固切片，光学显微镜高倍视野镜下观察。参照文献[7]对滑膜组织病理变化进行评分。滑膜细胞增生：未见异常；单层密集、肿胀为轻度异常；增生成2层为中度异常；增生成3层及以上为重度异常。炎性细胞浸润：未见异常；稀疏散在少量为轻度异常；较密集中等量中度异常；密集大量为重度异常。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 南五味子总三萜对大鼠关节炎足趾肿胀的影响 造模后，模型对照组、甲氨蝶呤组、南五味子中剂量组（因高、中、低3剂量组图片差异不大，选中剂量组治疗后模型）大鼠足趾关节肿胀情况见图1。给药前5组大鼠关节无明显差异，给药12，15，30 d，甲氨蝶呤组，南五味子高、中、低剂量组与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01），

给药15，30 d，南五味子高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2 5组大鼠关节滑膜MMP-1、MMP-3水平比较 南五味子高、中、低剂量组，甲氨蝶呤组与模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01或

P < 0.05），南五味子高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），南五味子中、低剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异无统计学意义

（P > 0.05）。见表2。

2.3 5组大鼠血清IgM、IgM2RF、IFN-γ水平比较 甲氨蝶呤组对IgM影响与模型对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；而南五味子高、中、低剂量组分别与甲氨蝶呤组、模型对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.01或P < 0.05）。在对血清IgM2RF影响方面，其他4组与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），南五味子高剂量组与甲氨蝶呤组比较，差异有统计学意义

（P < 0.05）。在对血清IFN-γ影响方面，南五味子高、中剂量组，甲氨蝶呤组与模型对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01），而南五味子低剂量组

2.4 5组大鼠踝关节滑膜组织病理切片观察 模型对照组CIA大鼠踝关节滑膜组织大量3层细胞增生，大量淋巴细胞浸润，为重度异常；南五味子高剂量组与甲氨蝶呤组滑膜细胞可见滑膜上皮少量单层增生，少量散在淋巴细胞浸润，为轻度异常；南五味子中、低剂量组可见滑膜中等量2层细胞增生，中量炎性细胞浸润，为中度异常。见

图2。

3 讨 论

临床中治疗RA的西药有非甾体抗炎药、改善病情抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂、靶向小分子药物等[8]，这些药物对RA有较强的治疗作用，但是与此同时，相关的不良反应如胃肠道刺激、肝肾功能损害、诱发肿瘤、骨质疏松、肥胖等问题层出不穷，而且大多数患者需要多种药物联合使用，加重药物不良反应的同时，也给患者及家属带来沉重的经济负担。目前的中成药制剂如正清风痛宁、雷公藤多苷相对便宜，但疗效有限，也会有皮疹、影响性功能等不良反应，导致患者难以长期维持用药[9]。因此，研究新型、疗效确切、不良反应少、价格适宜、患者依从性高的抗风湿药物形势非常迫切。而以植物的根茎叶果为主要成分的天然中草药治疗风湿病的研究也越来越多，既符合天人相应、药食同源的理念，又具有价廉效优、不良反应少、以人为本整体调理的特点，在风湿病的治疗领域独具特色。

在治疗风湿病的中草药研究中，一种名为血筒的少数民族药物引起我们的关注。这种药物在民间经常用于治疗风寒冷痛、手足身体麻木痹痛，以及久治不愈的慢性腰腿下肢疼痛。课题组前期研究过程中走访了粤北、湘西等多地的少数民族，得到切实的反馈，因他们祖祖辈辈居住在深山树林或者水边，容易感染风邪、寒邪以及湿邪导致头身困重、肢体疼痛、活动不利等，针對这些病痛，常用抗风湿俗称血筒、血通的草药，经鉴定是五味子科的异型南五味子，是中药鸡血藤的主要来源植物[10]，通常以植物的藤和茎部位入药，性温，味稍辛、甘，主要功效有行气补血、通络止痛、祛湿散寒、活血散瘀等。民间常用于治疗各种风寒湿痛以及麻木痹痛等病，异型南五味子的主要化学成分有三萜和木脂素类化合物[11]，其中主要有效成分是总三萜类化合物[12-13]。近期文献主要是针对三萜类化合物的细胞毒活性以及抗HIV作用开展研究[14]，表明南五味子总三萜在抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗HIV方面均有作用[15]。中医药方面的研究显示，南五味子属植物能活血通痹、散寒止痛、行气通络，主治风湿痹证、胸腹部胀痛、慢性腰腿疼痛、急慢性关节肿痛、腰肌劳损

等病。

基于该药在民间有较好的疗效以及安全性高的口碑，我们前期也对异型南五味子进行了相关的药效和毒理学方面的研究，本项目主要研究该药对RA的急性炎症期模型足部肿胀的抑制效果、慢性免疫炎症期模型体内部分炎性细胞因子免疫因子IgM、IgM2RF、IFN-γ，以及结缔组织关节液滑膜中介导阳性细胞因子的相关活性酶类MMPs变化情况。实验结果证实，异形南五味子高、中、低剂量组均对RA的急性炎症期组织肿胀疼痛有显著的缓解作用，与甲氨蝶呤组比较，南五味子高剂量组的抑制作用稍强。对于大鼠血清中IgM、IgM2RF、IFN-γ含量，南五味子高、中剂量组较模型对照组均有显著抑制作用（P < 0.01），且高剂量组较甲氨蝶呤组对IgM、IgM2RF抑制差异有统计学意义（P < 0.01），而低剂量组这3个指标有降低的趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05），可见在抑制细胞免疫方面，南五味子相对于传统的免疫抑制剂有独特的免疫调节功能，因此推测异型南五味子总三萜可能是通过抑制免疫炎性因子，阻断炎性因子介导的迟发型炎症反应，抑制关节滑膜炎的发生和关节破坏，从而起到控制RA病情发展的功效。MMPs是一种存在于结缔组织中的蛋白酶大家族，通过调控生长因子、炎性因子、组织抑制因子水平[16]，从而调控整个细胞免疫网络。MMPs的失衡在RA的发生、发展中尤为重要，特别是该家族中的MMP-1和MMP-3，在关节滑膜中数量增加，是滑膜炎性细胞增生、血管翳形成、关节软骨破坏等一系列直接导致病情进展的重要因素，因此MMP-1和MMP-3高阳性表达的抑制对缓解疾病至关重要。通过本实验观察发现，南五味子高剂量组在抑制滑膜MMPs高表达方面比甲氨蝶呤效果显著，而五味子中低剂量组也与甲氨蝶呤组效果相当；大鼠踝关节滑膜组织研究发现，与模型对照组比较，各治疗组滑膜内淋巴细胞等炎性细胞浸润减少，上皮增生减轻，据此可以推测异型南五味子总三萜可能是通过活性物质抑制MMPs的高表达，从而阻止由此介导的细胞炎性因子和免疫应答，减少抗原抗体复合物沉积，调控免疫网络，减轻滑膜炎症、缓解关节软骨破坏，阻止病情发展。

综上所述，在前期实验证实异型南五味子总三萜对RA动物模型有较好的急性期镇痛作用的基础上，本研究继续开展南五味子总三萜对RA的抗炎效果以及作用靶点探索。实验证明了异型南五味子各剂量组均对RA的急性炎症期大鼠组织肿胀疼痛有显著的缓解作用，且与传统的免疫抑制剂比较，对动物模型血清以及组织细胞炎性细胞免疫因子和致炎蛋白酶抑制效果较强，据此推测该药可能是通过阻断MMPs高表达，从而抑制炎性因子达到控制疾病进展的目的，下一步研究将进行其他部分相关指标观测以及人体关节滑膜液体外实验，确定异型南五味子总三萜对RA的作用机制以及作用靶点是否与本研究类似，同时也为这种具有较好抗风湿疗效的纯植物药物的研发使用奠定基础。

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收稿日期：2018-06-09；修回日期：2018-07-01