发酵型藤茶冲泡工艺及其抗氧化性能研究

秦振华，兰奎，刘梁，程群鹏，李建芬，*

（1.武汉轻工大学化学与环境工程学院，湖北武汉430023；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

藤茶学名显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），属于葡萄科蛇葡萄属，是一种野生藤本植物，主要分布于我国长江流域以南，如云南东南部、福建、两广、湖南等地，集中或散生于海拔400 m～1 300 m的山坡混交林中。自古以来，藤茶就有良好的保健作用，在我国南方民间应用历史悠久，应用范围广泛，对缓解咽喉肿痛、保肝护肝、醒脑安神等方面具有良好的应用效果[1-2]，民间多采其幼嫩茎叶加工成茶类产品，其味微甘、苦、性凉。藤茶富含黄酮类成分，据报道藤茶中总黄酮含量可高达41.2%左右，其中二氢杨梅素含量可达30%左右[3-5]。现代药理活性研究表明，二氢杨梅素具有极好的抗氧化活性，能够有效清除自由基[6]，在维持机体正常代谢和生理保健中起到了非常积极的作用[7-9]。

随着医疗模式逐渐由单纯的治疗型向预防、保健、康复相结合的模式转变，人们也越来越重视药食两用植物资源的保健作用。藤茶作为一种富含天然抗氧化物的饮品，成为了目前的研究热点[2，10]。但是藤茶的研究多集中于其加工工艺[11-12]、活性成分分析[13-14]、化学成分的含量测定[15-16]、藤茶黄酮提取工艺等方面[17-18]，对藤茶的冲泡工艺的研究鲜有报道。然而，藤茶作为一种健康饮品，与其他名茶类似，冲泡工艺也必将是影响其抗氧化活性的重要因素[19-21]。为了让藤茶的抗氧化活性在日常冲泡中得到充分有效的利用，对日常冲泡藤茶的主要因素进行系统考察，以期为科学饮用藤茶提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

发酵型藤茶：利川市多仁多实业有限公司；焦性没食子酸、盐酸、三（羟甲基）氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、七水硫酸亚铁、无水乙醇、水杨酸、30%过氧化氢：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

Nicolet IS10红外光谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；Lambda25紫外分光光度计：美国珀金埃尔默仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；RE-52AA旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；KQ5200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；AL204电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-C恒温振荡器：常州智博瑞仪器制造有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵：河南省予华仪器有限公司。

1.3 试验方法

以发酵型藤茶为样品，在不同冲泡温度、次数、水质、时间条件下进行试验，研究不同条件对藤茶茶汤抗氧化活性的影响。同时比较藤茶和绿茶的抗氧化能力，试验中采用水杨酸法和邻苯三酚法分别以羟基自由基清除率和超氧自由基清除率评价藤茶的抗氧化活性[14，22]。

1.3.1 水质对藤茶抗氧化活性的影响

称取3份1.0 g藤茶，分别用60 mL 80℃去离子水、自来水和泉水在恒温振荡器中冲泡20 min，振荡频率为150 r/min。过滤离心后，测定不同冲泡茶汤对自由基的清除率。

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1.3.2 茶汤用量对自由基清除率的影响

称取1.0 g藤茶，加入60 mL 80℃的去离子水在恒温振荡器中冲泡20 min，过滤后的滤渣继续同样操作进行第2次冲泡，滤液进行离心，测定加入不同用量1次和2次茶汤时的自由基清除率。

1.3.3 冲泡次数对藤茶抗氧化活性的影响

称取1.0 g藤茶加入60 mL 80℃的去离子水，在恒温振荡器中冲泡20 min，过滤后的滤渣继续同样操作的第2次冲泡、第3次冲泡直至第5次冲泡，滤液进行离心后测定不同冲泡次数的茶汤的自由基清除率。

1.3.4 冲泡时间对藤茶抗氧化活性的影响

称取1.0 g藤茶加入60 mL 80℃去离子水，在恒温振荡器中分别冲泡 10、20、30、40、50 min，过滤离心后测定茶汤的自由基清除能力。

1.3.5 冲泡温度对藤茶抗氧化活性的影响

称取1.0g藤茶加入60mL不同温度（50、60、70、80、90、100℃）的去离子水，在恒温振荡器中冲泡20 min后，过滤离心，测定茶汤的自由基清除能力。

分别称取1.0 g藤茶和1.0 g绿茶，分别加入60 mL 80℃的去离子水在恒温振荡器中冲泡20 min，过滤离心后，测定茶汤的自由基清除率。并将不同品种的茶汤各自分成两份，一份储藏在冰箱中，另外一份在室温环境下储存，每隔1、3、5、7天测定放置在不同环境中的茶汤的自由基清除能力。

2 结果与分析

2.1 藤茶的抗氧化研究

藤茶茶汤干燥物的红外光谱及藤茶的羟基自由基清除活性见图1。

其中图1（a）是藤茶茶汤经过70℃旋转蒸发所得干燥物的红外吸收光谱，其中波数3 125 cm-1的吸收峰由羟基振动吸收引起，波数1 633 cm-1的吸收峰由羰基振动吸收引起，波数1 549 cm-1和1 456 cm-1的吸收峰由芳环振动吸收引起，这与文献的二氢杨梅素的红外光谱结果一致[23]，说明藤茶茶汤的干燥物中含有丰富的二氢杨梅素，这为藤茶的抗氧化活性提供了充足的物质基础。试验中采用水杨酸法研究了藤茶茶汤对羟基自由基的清除能力，如图1（b）所示，空白对照试验中水杨酸与羟基自由基反应生成的2，3-二羟基苯甲酸在520 nm处有特殊吸收，而在反应体系中加入0.2 mL 1次茶汤后，520 nm处的吸光度明显降低，说明藤茶茶汤对羟基自由基有优异的清除能力。故而本试验选择反应体系在520 nm处吸光度的变化来考察冲泡工艺对茶汤抗氧化能力的影响。

图1 藤茶的红外光谱及抗氧化实验Fig.1 The IR spectroscopy and antioxidant research of vine tea

2.2 水质对羟基自由基清除率的影响

水质对羟基自由基清除率的影响如图2所示。

图2 水质对羟基自由基清除率的影响Fig.2 The effect of water quality on clearance rate of hydroxyl radical

结果表明自来水冲泡的抗氧化活性最低，主要是因为自来水中次氯酸的强氧化性氧化了藤茶中的有效成分，降低了藤茶的抗氧化活性，此外自来水中的杂质较多，采用自来水冲泡的茶汤色泽较深。如图所示去离子水冲泡的藤茶的抗氧化活性最高，0.5 mL 1次茶汤对羟基自由基的清除率达到了81.9%，冲泡效果最好，矿泉水其次，但日常生活中很难得到去离子水，所以综合考虑茶质和汤色，在日常冲泡藤茶时可选用矿泉水。

2.3 茶汤用量对羟基自由基清除率的影响

茶汤用量对羟基自由基清除率的影响见图3。

图3 茶汤用量对羟基自由基清除率的影响Fig.3 The effect of tea dosage on clearance rate of hydroxyl radical

在自由基清除率为20%～70%时，茶汤用量与清除率均呈良好的线性关系。但是当其清除率超过75%以后，茶汤的清除自由基能力上升开始变缓。图3a中羟基自由基清除率（y%）与1次茶汤用量（mL）之间线性方程是：y＝247.5x-6.5，线性拟合系数为0.99。图3b中自由基清除率线性方程是：y＝27.15x-6.13，线性拟合系数为0.99。一般可选用IC50值来表示不同抗氧化剂的抗氧化性强弱，IC50值表示半抑制浓度，采用该方法测定的1次茶汤和2次茶汤的IC50值分别为0.23 mL和2.07 mL。IC50值越低，抗氧化剂的自由基清除能力越强，可见1次茶汤溶出的抗氧化性物质明显多于2次茶汤。

2.4 冲泡次数对羟基自由基清除率的影响

冲泡次数对羟基自由基清除率的影响见图4。

分别取0.5mL茶汤考察其对羟基自由基的清除能力，其中冲泡1次的茶汤对羟基自由基的清除率达到了76.0%，而2、3、4、5次的茶汤清除效果明显下降，但2次茶汤对羟基自由基的清除率依然有31.5%，3、4、5次茶汤的自由基清除率已经降到了10%以下，这与图3的结果较为一致，表明发酵后的藤茶中抗氧化物质有较好的溶出能力，所以为了保证藤茶茶汤有较好的抗氧化能力，最佳冲泡次数为1次～2次。

图4 冲泡次数对羟基自由基清除率的影响Fig.4 The effect of different brewing times on the clearance rate of hydroxyl radical

2.5 冲泡时间对羟基自由基清除率的影响

冲泡时间对羟基自由基清除率的影响如图5所示。

图5 冲泡时间对羟基自由基清除率的影响Fig.5 The effects of brewing time on the clearance rate of hydroxyl radical

藤茶的抗氧化活性随冲泡时间的增加呈先增后减的趋势，在20 min时达到最大值，这说明藤茶中的抗氧化活性物质的溶出随时间的增加而增加，但在较高温度下保持过长时间时二氢杨梅素会发生不可逆的氧化反应，即冲泡时间过长会导致部分有效物质被氧化，茶汤的抗氧化活性反而降低，所以最佳冲泡时间不宜超过20 min。

2.6 冲泡温度对羟基自由基清除率的影响

冲泡温度对羟基自由基清除率的影响如图6所示。

在50℃至80℃的范围内，羟基自由基的清除率随温度升高而增加，80℃后，藤茶嫩芽嫩叶的易熟化、结膜，阻止了部分抗氧化物质的溶出，而100℃时清除率再次升高，可能原因是藤茶中一些抗氧化物质在该温度下溶出增加，尤其是一般认为藤茶中的主要成分二氢杨梅素易溶于热水，所以可能是二氢杨梅素在100℃下的溶出速率大于被氧化速率，而且考虑此温度下，文献表明茶叶中的茶多酚、维生素C等一些有益成分会遭到破坏[24]，同时图3和图4的结果已经表明发酵型藤茶中活性物质具有很好的一次溶出率，因此，过高的冲泡温度会影响后续的冲泡口感和风味。所以综合考虑建议藤茶的冲泡温度为80℃。

图6 冲泡温度对羟基自由基清除率的影响Fig.6 The effect of different brewing temperature on clearance rate of hydroxyl radical

2.7 藤茶最佳冲泡工艺的正交试验

根据单因素试验结果，选取冲泡温度（70、80、90℃）、冲泡时间（10、20、30 min）、冲泡次数（1、2、3）3 个因素，以0.2 mL冲泡茶汤的羟基自由基清除率为试验指标，设计三因素三水平正交试验[24-25]。正交试验的结果见表1。

表1 正交试验结果Table 1 Results of orthogonal test

极差分析显示，冲泡次数对发酵型藤茶茶汤的羟基自由基清除率有很大的影响，这说明藤茶经过发酵处理后，其中的活性成分有较好的溶出效果。从表1发现影响藤茶茶汤的抗氧化活性的主次关系为冲泡次数＞冲泡温度＞冲泡时间，最佳冲泡工艺组合为A2B2C1，即冲泡温度为80℃，冲泡时间20 min，冲泡1次，验证试验显示此条件下0.2 mL冲泡茶汤的羟基自由基清除率可以达到48.2%，说明此时冲泡得到的藤茶茶汤具有最佳的抗氧化活性。

2.8 藤茶和绿茶放置时间对羟基自由基清除率的影响

藤茶和绿茶放置时间对羟基自由基清除率的影响见图7。

图7 藤茶和绿茶放置天数对羟基自由基清除率的影响Fig.7 The effect of days of vine tea and green tea on clearance rate of hydroxyl radical

结果表明藤茶的抗氧化性明显强于绿茶，放在冰箱中的藤茶和绿茶茶汤的抗氧化活性随着放置天数的增加而基本不变。然而，放在室温下的绿茶茶汤的抗氧化活性明显下降，而藤茶茶汤的抗氧化活性变化较小，这与民间形容藤茶茶汤经久不馊的说法相契合，说明藤茶的抗氧化能力在室温下具有很高的稳定性。

2.9 藤茶茶汤对超氧阴离子自由基的清除作用

藤茶茶汤对超氧阴离子自由基的清除作用见图8，邻苯三酚自氧化和加入一次茶汤后反应体系的吸光度随时间变化关系见图9。

结果表明在200 nm～800 nm的波长范围内空白邻苯三酚没有出现吸收峰，邻苯三酚自氧化体系的吸收峰在320 nm处和420 nm处，加入1次茶汤抑制后的反应体系可能因为黄酮类物质的存在，使得反应体系的吸收峰在320 nm处与自氧化的重叠且高于后者，但是在420 nm处自氧化出现的吸收峰被抑制，说明藤茶茶汤对超氧阴离子自由基也有良好的的清除作用。因为320 nm处的吸收峰要强于420 nm处，所以本试验选用320 nm作为吸光度的作为测量波长，茶汤在该波长下的吸收可采用空白对照进行消除。由图分析可知，邻苯三酚自氧化速率（min-1）为0.060，而加入茶汤后邻苯三酚自氧化速率有所下降，此时的速率（min-1）为0.039，从而可得出茶汤对邻苯三酚自氧化的抑制率为35%，说明藤茶茶汤对超氧阴离子自由基也有较好清除能力。

图8 邻苯三酚紫外可见光光谱图Fig.8 UV-Vis spectrum of pyrogallol

图9 反应体系的吸光度随时间变化Fig.9 The absorbance of the reaction system varies with time

3 结论

以羟基自由基的清除率为评价标准，模拟日常生活中藤茶的冲泡工艺，采用水杨酸法对水质、温度、冲泡次数、时间等条件进行了研究，同时还采用邻苯三酚法作为辅助手段，以超氧阴离子自由基的清除率为标准，对部分冲泡工艺进行了考察，发现日常生活中藤茶的最佳冲泡工艺为用80℃去离子水单次冲泡20 min，此时0.2 mL茶汤对羟基自由基的清除率可达到48.2%，当茶汤的用量达到0.5 mL时，其对羟自由基的清除率甚至可以达到81.9%，这体现了藤茶优异的抗氧化活性。正交试验表明影响藤茶茶汤的抗氧化活性的主次关系为冲泡次数＞冲泡温度＞冲泡时间。同时通过比较藤茶和绿茶这两种茶叶，发现藤茶对羟基自由基的清除率明显高于绿茶，且在放置数天的情况下，藤茶对羟基自由基的清除率基本不变，而绿茶则显著下降，这说明藤茶具有优异和稳定的抗氧化性能，是一种理想的日常饮品。