头花蓼好氧、厌氧腐解液的化感自毒作用

刘 勇，刘 燕，王星星，赵许朋，杨 丹，胡茂飞

(1.贵阳学院 生物与环境工程学院，贵州 贵阳 550005； 2.中国科学院 地球化学研究所 环境地球化学国家重点实验室，贵州 贵阳 550002； 3.中国科学院大学，北京 100049)

头花蓼(PolygonumcapitatumBuch.-Ham.ex D.Don)又名石莽草、四季红等，为蓼科蓼属多年生草本植物，主要分布于贵州、四川、云南等地，是中国西南地区的特色苗药之一，其主要药用成分没食子酸具有酸化尿液等作用，对泌尿系统疾病颇具疗效[1-3]。头花蓼为贵州省著名的道地药材，近年来贵州威门药业股份有限公司生产的热淋清颗粒是以此药材开发的用于治疗尿路感染的特效药[4-5]。然而，在头花蓼栽培过程中发现其连作障碍问题一直比较突出，对其种植产量和药用成分品质影响较大，成为制约当地该产业可持续发展的主要因素[6-8]。

化感自毒作用指植物根系分泌、茎叶等淋溶以及残体腐解等过程释放出的次生代谢产物(化感物质)，对自身或种内其他植物产生危害的现象[9-10]。近年来研究发现，地黄、当归、人参等许多中药材连作障碍与化感自毒作用有关[11-14]。中药材的化感物质除了根系分泌、茎叶等淋溶产生外，也通过自然凋落的残体或收获后遗留的残茬经微生物腐解产生[15-16]。目前头花蓼连作障碍成因还不清楚，其腐解液引起的化感自毒作用尚未见报道。为此，制备头花蓼整株好氧、厌氧腐解液，采用生物学试验分析2种腐解液对其种子萌发和幼苗生长的影响，为头花蓼连作障碍的成因分析及防治措施制定提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 样品采集

2016年4月于贵州省威门药业股份有限公司头花蓼种植基地分别采集生长旺盛的新鲜头花蓼整株、根际土壤及头花蓼种子若干。

1.2 头花蓼整株腐解液制备

将新鲜头花蓼整株(含根、茎、叶)用无菌蒸馏水清洗干净，沥干水分，剪碎混匀，准确称量100.0 g置于烧杯中，并加入根际土壤10.0 g(土壤样品在室温条件下风干，研细后，过孔径为450 μm的筛子，用于提供微生物)，定期加入蒸馏水维持至110 mL体积，室温下敞口好氧培养。采用同样的方法对头花蓼和根际土壤进行前处理并置于玻璃瓶中，加入110 mL蒸馏水后排出瓶内空气，室温下封口厌氧培养。60 d后抽滤得到头花蓼好氧、厌氧腐解原液(1 000 mg/mL)，并进一步稀释得到5、10、50、100、250、500 mg/mL的2种腐解培养液，冷藏备用。

1.3 种子萌发试验

取3 000粒头花蓼种子置于烧杯中，35 ℃温水浸泡24 h，挑选籽粒饱满的种子，置于垫有2层滤纸的培养皿中(培养皿、滤纸均灭菌)。每个培养皿摆放40粒，加入不同质量浓度的2种腐解液5 mL至滤纸湿润饱和，3次重复，用蒸馏水作对照(CK)。置于人工培养箱(22 ℃、12 h光照和12 h黑暗)中培养，每2 d加蒸馏水和1 d加对应腐解液确保皿内滤纸湿润饱和，连续培养27 d，每天观察、统计种子萌发数，直到持续3 d不再有新种子发芽为止，用直尺测量种子胚根(芽)长。

1.4 幼苗生长试验

种子萌发试验结束后，每皿选取发芽良好的种子，去掉皿盖继续培养10 d使幼苗生长，用直尺测量幼苗根(芽)长。

1.5 数据统计分析

发芽率=(发芽种子数/供试种子数)×100%[17]。

发芽抑制率=(1-发芽种子数/对照组发芽种子数)×100%，负值为促进，正值为抑制[18]。

发芽速率=N1+(N2-N1)/2+…+(Nt-Nt-1)/t，其中，Nt为t日内种子发芽率[19]。

发芽势=(发芽高峰期种子数/供试种子数)×100%，表征种子发芽快慢与活力强弱[18]。

发芽指数GI=∑(Gt/Dt)，Gt为第t天种子发芽数，Dt为相应种子发芽天数[20]。

活力指数VI=∑(Gt/Dt)×Sx，其中，Sx为种苗平均总长度[21]。

化感指数RI=1-C/T，其中，C为对照组各指标平均值，T为腐解液培养时各指标平均值。RI>0为促进，RI<0为抑制[22]。

综合化感指数M：各处理的化感指数RI值相加求和为M值，M>0 为促进，M<0为抑制，绝对值大小表征作用强弱[23]。

采用Excel 2010、SPSS 22.0处理数据，采用Sigmaplot 10.0绘图。

2 结果与分析

2.1 腐解液处理下头花蓼种子发芽表观特征

由表1可知，头花蓼好氧、厌氧2种腐解液对其种子最终发芽数、日均发芽数、胚根长等均有一定抑制作用，出现种子胚根(芽)倾倒、腐烂症状。随着好氧腐解液质量浓度升高(5～500 mg/mL)，种子最终发芽数由18粒降至7粒，日均发芽数由1.1粒降至0.5粒，胚根长由1.4 cm降至0.6 cm，(胚)根芽比由1.2降至0.4，胚芽长与对照组差异不显著。随着厌氧腐解液质量浓度升高(5～500 mg/mL)，种子最终发芽数由22粒降至8粒，日均发芽数由1.4粒降至0.5粒，胚根长由1.6 cm降至0.5 cm，胚芽长由2.4 cm降至0.7 cm，(胚)根芽比与对照组差异不显著。

表1 2种腐解液处理下头花蓼种子发芽表观特征

注：同一种腐解液处理下不同字母代表差异性显著(P<0.05)，下同。

2.2 腐解液处理下头花蓼种子发芽率、发芽速率

随着头花蓼好氧、厌氧腐解液质量浓度升高(5～500 mg/mL)，种子发芽率分别由45.0%降至18.3%、55.8%降至20.8%，其中好氧、厌氧腐解液质量浓度分别≤10 mg/mL、≤50 mg/mL时，种子发芽率与对照组差异不显著，质量浓度进一步升高时种子发芽率均显著低于对照组(P<0.05)，2种腐解液质量浓度相同时好氧腐解液处理下种子发芽率均值总体偏低(图1a)。好氧、厌氧腐解液质量浓度均≤50 mg/mL时，种子发芽速率与对照组差异不显著，但高质量浓度时种子发芽速率分别降至对照组的1/3、1/4。2种腐解液质量浓度均≤100 mg/mL时，厌氧腐解液处理下发芽速率普遍略高于好氧腐解液处理，而质量浓度>100 mg/mL时相反(图1b)。

不同小写字母代表不同腐解液处理之间差异显著(P<0.05),下同图1 2种腐解液处理下头花蓼种子发芽率和发芽速率

2.3 腐解液处理下头花蓼种子发芽势、发芽抑制率

好氧腐解液质量浓度≤250 mg/mL时，种子发芽势与对照组差异不显著，但质量浓度为500 mg/mL时发芽势降至12.5%；厌氧腐解液质量浓度≤50 mg/mL时，种子发芽势与对照组差异不显著，随着质量浓度升高，种子发芽势降至4.2%(图2a)。2种腐解液处理下种子发芽抑制率均为正值，且随着质量浓度升高种子发芽抑制率呈现递增趋势，其中好氧腐解液处理下由17.8%增至67.2%，厌氧腐解液处理下由0增至62.4%(图2b)。

图2 2种腐解液处理下头花蓼种子发芽势和发芽抑制率

2.4 腐解液处理下头花蓼种子发芽指数、活力指数

好氧、厌氧腐解液质量浓度均≤50 mg/mL时，种子发芽指数与对照组差异不显著，分别介于11.2～12.3、12.8～14.9，随着质量浓度进一步升高，种子发芽指数分别逐渐下降至4.1、2.5(图3a)。好氧腐解液处理下除在100、500 mg/mL时种子活力指数较小(分别仅为19.2、9.1)，其余质量浓度下与对照组差异不显著，介于32.3～47.0。厌氧腐解液质量浓度≤10 mg/mL时，种子活力指数与对照组差异不显著，介于49.3～55.3，随着质量浓度进一步升高种子活力指数下降趋势明显，最低仅为3.1(图3b)。

图3 2种腐解液处理下头花蓼种子发芽指数和活力指数

2.5 腐解液处理下头花蓼种子发芽率、发芽势、发芽指数RI和综合化感指数M

由表2可知，好氧腐解液处理下种子发芽率、发芽势和发芽指数的RI值以及综合化感指数M值均为负值，随着质量浓度升高RI和M的绝对值呈增加趋势。厌氧腐解液处理下，质量浓度为5 mg/mL时种子发芽率RI值为0，质量浓度≤10 mg/mL时种子发芽势RI值为正值，质量浓度≤50 mg/mL时发芽指数RI值为正值，质量浓度进一步升高时，各指标RI值以及综合化感指数M值均为负值且其绝对值不断增加。

表2 2种腐解液处理下头花蓼种子发芽化感指数

2.6 腐解液处理下头花蓼幼苗生长表观特征

头花蓼2种腐解液对幼苗根长、芽长产生不同程度的影响，且高质量浓度时幼苗根(芽)倾倒、腐烂加剧(表3)。好氧腐解液质量浓度≤10 mg/mL时，幼苗根长与对照组差异不显著，随着质量浓度升高幼苗根长降至1.0 cm；质量浓度≤250 mg/mL时幼苗芽长与对照组差异不显著，但质量浓度为500 mg/mL时幼苗芽长降至1.6 cm；幼苗根芽比无明显变化规律，介于0.4～0.7。厌氧腐解液处理下幼苗根长、芽长总体略小于对照组，且具有先增加后减小的趋势，当质量浓度为10 mg/mL时分别达最大值1.7 cm、2.9 cm，当质量浓度为500 mg/mL时分别仅为0.4 cm、1.8 cm；质量浓度≤250 mg/mL时幼苗根芽比与对照组无显著差异，当质量浓度为500 mg/mL时幼苗根芽比骤降至0.2。

表3 2种腐解液处理下头花蓼幼苗生长表观特征

2.7 腐解液处理下头花蓼种子发芽与幼苗生长各指标相关性分析

头花蓼好氧、厌氧腐解液处理下种子发芽率、发芽速率、发芽势、发芽指数、活力指数等均与腐解液质量浓度呈极显著负相关，发芽抑制率与腐解液质量浓度呈极显著正相关；种子发芽率、发芽速率、发芽势、发芽指数及活力指数等指标之间均呈极显著正相关，而各指标与发芽抑制率均呈极显著负相关(表4、表5)。好氧腐解液处理下种子胚根长、幼苗根长与腐解液质量浓度，种子(胚)根芽比与幼苗根长，幼苗芽长与根芽比，均呈极显著负相关；种子胚根长与幼苗根长，种子(胚)根芽比与幼苗根芽比，均呈极显著正相关；种子(胚)根芽比与腐解液质量浓度呈显著负相关；幼苗根长与根芽比呈显著正相关(表6)。厌氧腐解液处理下种子胚根长、胚芽长及幼苗根长、芽长、根芽比均与腐解液质量浓度呈极显著负相关，种子胚根长与胚芽长及幼苗根长、根芽比，种子胚芽长与幼苗根长、芽长，幼苗根长与芽长、根芽比均呈极显著正相关；种子胚根长与幼苗芽长，种子胚芽长与幼苗根芽比呈显著正相关，而种子胚芽长与(胚)根芽比呈显著负相关(P<0.05)(表7)。

表4 好氧腐解液处理下头花蓼种子发芽指标相关性

注：**代表在0.01水平上极显著相关，*代表在0.05水平上显著相关，下表同。

表5 厌氧腐解液处理下头花蓼种子发芽指标相关性

表6 好氧腐解液处理下头花蓼种子及幼苗(胚)根芽相关性

表7 厌氧腐解液处理下头花蓼种子及幼苗(胚)根芽相关性

3 结论与讨论

中药材连作障碍与其化感物质的关系一直是目前的研究热点。化感物质除根系分泌和茎、叶淋溶等作用产生外，自然凋落的残体或收获后遗留的残茬经土壤微生物分解产生的腐解液也是化感物质的重要来源[9-10，24]。中药材腐解液中的化学成分包含酚酸类、有机酸类、醛类、烃类等物质，并且随着残体时段及腐解方式等不同，其化学成分种类与数量往往差异较大，会改变土壤pH值、电导率、有机质、养分状况、酶类活性、微生物群落结构等，进而影响种子发芽及幼苗生长发育等[25-29]。刘伟等[30]研究表明，丹参须根腐解产生辛酸、乙醛等一系列化感物质，显著改变丹参根际土壤环境，促使其连作障碍的形成。吴艳艳等[31]研究表明，广藿香重茬土和枯叶腐解液使广藿香幼苗叶片过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量发生明显变化，这种变化反映了其对外界胁迫的响应。张秋菊等[32]研究表明，细辛根系腐解液可能受土壤微生物影响，加重其毒性作用。

本研究中，头花蓼整株通过好氧、厌氧2种方式产生的腐解液引起头花蓼种子和幼苗(胚)根芽倾倒、腐烂等现象，2种腐解液质量浓度较低时未产生明显的抑制作用，但种子和幼苗(胚)根长、(胚)芽长值的标准偏差较大，表明2种腐解液使得种子发芽和幼苗生长齐整度明显变差。随着腐解液质量浓度升高至500 mg/mL，好氧、厌氧腐解液处理种子发芽率分别仅为18.3%、20.8%，发芽速率分别仅为对照组的1/3、1/4，发芽势分别仅为12.5%、4.2%，发芽指数分别仅为4.1、2.5，活力指数分别仅为9.1、3.1，均远低于对照组，而发芽抑制率均为正值且分别高达67.2%、62.4%，种子发芽率、发芽势、发芽指数的RI值及综合化感指数M值大多为负值，且绝对值随着腐解液质量浓度升高增加趋势明显。另外，头花蓼种子发芽或幼苗生长中大多数指标均与2种腐解液质量浓度呈(极)显著负相关，种子发芽抑制率与2种腐解液质量浓度呈极显著正相关，而其他大多数指标之间呈(极)显著正相关，说明头花蓼受到腐解液抑制作用后种子活力下降，进而发芽率、发芽速率、(胚)根芽长等显著下降。

综上，头花蓼好氧、厌氧腐解液均具有明显的化感自毒作用，很可能是引起其连作障碍的重要原因。2种腐解液中化感物质鉴定及其关键物质的致“毒”机制等尚有待进一步研究。在头花蓼栽培中，建议加强良好农业规范(GAP)种植基地的科学规范化管理并积极做好连作障碍的预防，即头花蓼收获后及时清理土壤中的植株残茬，连作前可通过深耕翻土与烈日暴晒达到土壤消毒目的，筛选培育抗逆性强的新型品种，采用多物种轮(间、套)作等农艺手段避免连作障碍的发生。

致谢：感谢贵州威门药业股份有限公司为本研究开展提供便利。