化学诱变剂EMS对知母种子萌发的影响

杨 楠 聂江力 辛 微 夏 徐 郎玉洁 裴 毅

(天津农学院园艺园林学院，天津 300384)

知母(Anemarrhenaasphodeloides)为百合科(Liliaceae)知母属(Anemarrhena)多年生草本植物，其干燥根茎可入药，有清热泻火，生津润燥的药用功效[1]。知母中含有皂苷类、双苯吡酮类等多种有效成分，在抗老年性痴呆，研究抗癌药物或先导化合物等方面具有较高的研究价值和良好的开发前景[2]。知母的耐盐碱能力较强，目前在天津也已经试种成功，但知母植株较高，种植凌乱，且品种混乱，质量较差，产量较低，所以需要在原有种质资源的基础上选育性状更加优良的新品种。

诱变可使植物形成自然界没有的或常规方法较难获得的新性状和新基因，同时还避免了转基因在安全和后代稳定性上的问题。在众多化学诱变试剂中，甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate，EMS)是目前作物诱变育种中应用最广泛、效果最好的化学诱变剂之一[3～4]。其原因是利用EMS诱变技术创制突变体，容易形成点突变，但又不会造成染色体畸变[5]。我国化学诱变育种起步较早，已经取得了令世人瞩目的成就，诱变育成的品种数量和种植面积也居世界第一[6]。目前，很多学者在水稻[7]、拟南芥[8]、大麻[9]和西葫芦[10]等植物上做了深入的EMS诱变技术的研究，陈绍江等[11]利用EMS诱变处理玉米花粉，获得了玉米的高油突变体。

目前，国内关于知母的研究主要集中在其活性成分和药用效果，针对优良知母品系的诱变育种的研究较少。有学者利用我国发射的神舟三号宇宙飞船搭载知母种子进行航天诱变，回收繁殖后发现知母中的微量元素指标明显优化[12]，但航天诱变不易普及。因此，本试验用不同浓度EMS处理知母种子，确定知母种子诱变的适宜EMS浓度和处理时间，为创新种质资源、选育知母新品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

知母(A.asphodeloides)种子采收自天津市蓟州区翠屏湖科学园中药种植基地。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理与发芽实验

选取完整、饱满的知母种子，用高锰酸钾溶液浸泡30 min进行消毒除菌。EMS溶液用0.01 mol·L-1(pH=7.0)的磷酸缓冲液配制，设置5个浓度(V/V)，分别是0%、1%、2%、4%、6%，每个浓度分别浸种6、8、12、24 h，每组处理3次重复，处理后的种子用流水冲洗2 h，然后置铺有2层滤纸的培养皿中，于25℃恒温培养箱中进行发芽试验。

1.2.2 发芽指标与数据处理

计算发芽率、相对发芽率和相对致死率等指标，各指标计算方法如下：

发芽率(%)=9d内正常萌发种子数/种子总数×100%

(1)

相对发芽率(%)=各EMS浓度诱变处理组的发芽率/对照组的发芽率×100%

(2)

相对致死率(%)=(对照组发芽率-各处理组的发芽率)/对照组的发芽率×100%

(3)

试验数据用Excel进行统计处理，用SPSS22.0对计算结果进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度EMS诱变处理6 h对知母种子萌发的影响

不同EMS浓度诱变处理知母种子6 h后置恒温培养箱发芽第9天的发芽率、相对发芽率、相对致死率见表1。随着EMS浓度的增加，知母种子的发芽率、相对发芽率呈下降趋势，相对致死率逐渐上升。浓度2%处理下，第9天的发芽率57.8%，相对发芽率85.2%，低于对照组，4%浓度EMS诱变处理组发芽率54.4%，显著低于对照组，6%浓度EMS诱变处理组发芽率为48.9%，低于对照组，差异极显著。

表1不同浓度EMS诱变处理6h对知母种子萌发的影响

Table1EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor6honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS浓度EMS concentration(%)发芽率Germination rate(%)相对发芽率Relative germination rate(%)相对致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.01abAB1000170.0±3.33aA103.3-3.30257.8±3.85bcAB85.214.75454.4±3.85cBC80.319.67648.9±7.69cC72.127.87

由图1可知，不同浓度EMS诱变处理6 h的知母种子从第2天开始有发芽，对照组第5天的发芽率为47.8%，浓度2%、4%、6%诱变处理组第5天的发芽率分别为41.1%、38.9%、41.1%。对照组在第5天后，日发芽数逐渐减少，第7天后不再新增发芽。除浓度1%处理组在第9天发芽率高于对照组之外，其余处理组在第5天之后的发芽率均低于对照组。

2.2 不同浓度EMS诱变处理8 h对知母种子萌发的影响

不同EMS浓度诱变处理知母种子8 h后，置恒温培养箱发芽试验。随着EMS浓度的增加，知母种子的发芽率、相对发芽率逐渐降低，相对致死率逐渐升高(表2)。2%浓度EMS诱变处理组在第9天的发芽率54.4%，相对发芽率80.3%，低于对照组；4%浓度EMS诱变处理组发芽率为53.3%，显著低于对照组，6%浓度EMS诱变处理组发芽率为44.4%，低于对照组，差异显著。

表2不同浓度EMS诱变处理8h对知母种子萌发的影响

Table2EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor8honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS浓度EMS concentration(%)发芽率Germination rate(%)相对发芽率Relative germination rate(%)相对致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000157.8±13.5abA85.214.8254.4±11.7abA80.319.7453.3±8.8abA78.721.341644.4±10.7bA65.634.4

由图2可知，1%和4%浓度处理在第2天开始发芽，2%、6%和对照组在第3天开始发芽，对照组在第5天的发芽率为42.2%，浓度2%、4%、6%诱变处理组第5天的发芽率分别为33.3%、31.1%、23.3%。对照组和各处理组在第5天日发芽数最高，第5天后，日发芽数逐渐减少，第7天后不再新增发芽。各处理组在第5天之后的发芽率均低于对照组。

图2 不同浓度EMS处理知母种子8 h后种子累计发芽曲线Fig.2 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 8 h treatment with different concentrations of EMS

2.3 不同浓度EMS诱变处理12 h对知母种子萌发的影响

不同EMS浓度诱变处理知母种子12 h，置恒温培养箱发芽第9天的发芽率、相对发芽率、相对致死率见表3。随着EMS浓度的增加，知母种子的发芽率、相对发芽率逐渐降低，相对致死率逐渐上升。2%浓度EMS诱变处理组在第9天的发芽率56.7%，相对发芽率83.6%，低于对照组；4%浓度EMS诱变处理组发芽率为52.2%，低于对照组，差异显著；6%浓度EMS诱变处理组发芽率为36.7%，低于对照组，差异极显著。

由图3可知，对照组和6%浓度处理在第2天开始发芽，1%、2%、4%浓度处理组在第3天开始发芽，对照组在第5天的发芽率为55.6%，浓度2%、4%、6%诱变处理组第5天的发芽率分别为32.2%、26.7%、23.3%。对照组和各处理组在第5天日发芽数最高，第5天后，日发芽数逐渐减少，第7天后不再新增发芽。各处理组在第5天之后的发芽率均低于对照组。

表3不同浓度EMS诱变处理12h对知母种子萌发的影响

Table3EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor12honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS浓度EMS concentration(%)发芽率Germination rate(%)相对发芽率Relative germination rate(%)相对致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000163.3±5.8abA93.46.6256.7±3.3abAB83.616.4452.2±4.0bAB77.023.0636.7±8.8cB54.145.9

图3 不同浓度EMS处理知母种子12 h后种子累计发芽曲线Fig.3 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 12 h treatment with different concentrations of EMS

2.4 不同浓度EMS诱变处理24 h对知母种子萌发的影响

不同EMS浓度诱变处理知母种子24 h，置恒温培养箱发芽第9天的发芽率、相对发芽率、相对致死率见表4。随着EMS浓度的增加，知母种子的发芽率、相对发芽率逐渐降低，相对致死率逐渐上升。2%浓度EMS诱变处理组在第9天的发芽率61.1%，相对发芽率90.2%，低于对照组；4%浓度EMS诱变处理组发芽率为44.4%，低于对照组，差异极显著；6%浓度EMS诱变处理组发芽率为38.9%，低于对照组，差异极显著。

表4不同浓度EMS诱变处理24h对知母种子萌发的影响

Table4EffectofdifferentconcentrationsofEMSfor24honthegerminationofA.asphodeloidesseed

EMS浓度EMS concentration(%)发芽率Germination rate(%)相对发芽率Relative germination rate(%)相对致死率Relative fatality rate(%)0(ck)67.8±4.0aA1000161.1±2.9aAB90.29.8261.1±5.9aAB90.29.8444.4±2.2bBC65.634.4638.9±4.4bC57.442.6

图4 不同浓度EMS处理知母种子24 h后种子累计发芽曲线Fig.4 Cumulative germination curve of A.asphodeloides seed after 24 h treatment with different concentrations of EMS

由图4可知，不同浓度EMS诱变处理24 h的知母种子从第2天开始有发芽，对照组第5天的发芽率为48.9%，浓度2%、4%、6%诱变处理组第5天的发芽率分别为45.6%、31.1%、23.3%。对照组在第5天后，日发芽数逐渐减少，第7天后不再新增发芽。各处理组在第5天之后的发芽率均低于对照组。

2.5 不同浓度EMS诱变对知母种子萌发的影响

由图5可见，随EMS浓度增加，种子发芽率呈现逐渐增加的趋势。当处理时间为6 h时，发芽率较高的是1%和对照组，且1%处理下种子发芽率高于对照组，在70%以上，其次是浓度2%、4%和6%处理，发芽率均在60以下，且与对照组差异显著，发芽率最低的浓度6%处理组(48.67%)较发芽率最高的1%处理组(70.33%)降低了21.66%。当处理时间为8 h时，浓度1%处理的发芽率降低到57.67%，较6 h时的浓度1%处理发芽率降低了12.66%。浓度2%、4%和6%处理下的发芽率也有所降低，但变化幅度较小。当处理时间为12 h时，浓度1%处理下发芽率(73.00%)高于对照组，为所有处理组的最高值。其余浓度处理组的发芽率均降低。当处理时间为24 h时，浓度1%处理的发芽率高于8 h处理，浓度2%处理的发芽率高于其他处理时间，浓度6%处理的发芽率高于12 h处理。

图5 不同浓度EMS对知母种子发芽率的影响Fig.5 The effect of different EMS concentration on germination rate of A.asphodeloides seeds

从表5可知，不同浓度EMS处理对知母种子发芽率影响极显著，P<0.01，处理时长则不是影响知母种子萌发的主体因素，同时EMS浓度和处理时长的交互作用对知母种子萌发的影响较小。

表5不同浓度和时间处理下知母种子发芽率的方差分析表

Table5VarianceanalysisofgerminationrateofA.asphodeloidesseedsunderdifferentconcentrationsandtimetreatments

来源Source平方和SSType Ⅲ Sum of Squaresdf均方S2Mean SquareFP浓度Concentration5810.13941452.53512.8690.000 时间Time557.5113185.8371.6460.190 浓度/时间Concentration/time1368.84512114.0701.0140.455 误差Error5869.37152112.873

3 讨论

利用化学诱变育种已在植物研究领域中被广泛研究和利用，选择适宜的诱变剂对于获得理想性状是十分重要的。EMS是一种通过直接修饰碱基的化学结构而改变DNA性质的稳定、高效的诱变剂[13]，具有诱变效率高、范围广、频率高等优点，已在大田作物突变体库构建和种质创新中得到广泛应用[14]。

进行诱变育种研究的关键是确定最佳的诱变条件，通常以半致死浓度为最适宜诱变条件[15]。诱变条件的选择与种子的大小，种皮的透水性等因素相关。如种子较小的十字花科植物油菜[16]、大白菜[4]的种子的最佳诱变浓度和时间分别为0.2% 8 h和0.4%～0.6% 4 h，豆科牧草紫花苜蓿种子[17]的最佳诱变浓度为1.6% 8 h。种子的发芽率是良好的种子活力的测定指标，有学者设置4个EMS浓度(0%，1%，2%，3%，4%)分别处理加工番茄干种子0、6和12 h，结果表明，4%浓度处理12 h时，干番茄种子发芽率接近半致死剂量[18]。本试验将浓度设置为1%、2%、4%和6%，时间设置为6、8、12和24 h，与前人设置的浓度和时间有所不同。通过对知母种子发芽效果进行分析，结果表明处理时间为6和8 h时，知母种子发芽率随EMS浓度增加而减小，且4%浓度EMS处理下，发芽率接近50%，接近半致死剂量；当处理时间为12和24 h，2%和4%浓度处理下发芽率接近50%，浓度增加到6%时，发芽率为36.67%，显著低于对照组，表明6%EMS处理对种子萌发损伤较大。

4 结论

知母是一种常用的中药材，对人体的中枢神经系统、免疫系统和运动系统有显著的药理作用。本研究通过设定4个浓度梯度和4个时间梯度对知母种子进行处理，结果表明EMS浓度为4%，处理时间为12和24 h时，发芽率比较接近50%，接近半致死剂量，确定适宜条件是浓度为4%，浸种12和24 h。通过浓度梯度和时间梯度筛选出用于EMS处理知母种子的最佳浓度和时间，为后续构建知母诱变群体，筛选品质优化的知母新品种奠定基础。