牛蒡根际土壤解磷菌的筛选、鉴定及生长特性

王样庭，陈 玲，王 陶，李 文*，李同祥，刘 洵

(1.徐州工程学院/江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018； 2.徐州万荷奶牛专业合作社，江苏 徐州 221113)

磷作为一种植物必需的大量元素，对植物的生长、代谢、发育起到至关重要的作用[1-2]。然而，土壤中的磷只有0.1%可被植物所用，大部分磷是以无效磷的形式存在[3]。长期以来，人们通过施用磷肥来解决这一问题，然而，磷会和土壤中的金属离子如Al3+、Fe3+、 Ca2+等结合，转化成无效形式，并造成土壤肥力及生物多样性下降等问题[4]。因此，提高磷的有效性是当务之急[5]。土壤中存在一类解磷微生物，可以将无效磷转变成植物能吸收的状态，从而促进植物的生长[6]。解磷微生物可以分为解磷细菌、真菌和放线菌，其中，解磷细菌按其种属可分为肠细菌属(Enterbacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、欧文氏菌属(Er-winia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococcus)、固氮菌属(Azotobacter)、色杆菌属(Chromabacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、产碱菌属(Alcaligenes)、节细菌属(Arthrobacter)、硫杆菌属(Thiobacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)；解磷真菌方面的相关研究报道不多，大多为曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属(Penicillium)、小菌核菌属(Sclerotium)、AM菌根菌(Arbuscularmycorrhiza)等；解磷放线菌的研究主要侧重于链霉菌属(Streptomyces)[7-9]。解磷微生物作为传统磷肥的一个良好的替代品，除了可以释放磷元素供植物生长所需，还可以维持土壤生态系统的长期平衡[10]，从而缓解施用磷肥带来的环境问题。因此，筛选高效解磷微生物以研制具有高解磷能力的生物肥料迫在眉睫。通常，分离自不同土壤的解磷菌在生长和解磷性能上呈现出较大的差异。因此，对于不同解磷菌的分离鉴定及生长特性的研究具有重要意义，能够丰富野生解磷菌资源，并为解磷菌的应用提供一定的基础。

牛蒡 (ArctiumlappaL.)，俗称东洋参，是菊科牛蒡属草本植物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种药理活性[11]，江苏省徐州市的沛县、丰县是中国主要的种植地区。对牛蒡根际促生细菌如解磷菌进行研究有助于提高牛蒡的产量，更好地发挥其功效。目前，关于土壤解磷细菌的筛选、鉴定研究较多，多筛选于小麦、大豆、棉花、花生、烟草、油茶、茶树等的根际土壤，并具有较好的解磷特性[12-24]，而对牛蒡根际解磷菌的研究鲜有报道。为此，从牛蒡根际土壤中筛选具有优良解磷性能的菌株，并对其进行鉴定，研究其生长特性，以期为开发牛蒡专用菌肥提供一定的理论参考和技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤 土样为徐州市丰县牛蒡根际土壤。

1.1.2 培养基 无机磷液体培养基：葡萄糖10.0 g、Ca3(PO4)2 25.0 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.5 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH 值6.8～7.2，121 ℃灭菌20 min。

筛选培养基：无机磷液体培养基中加入琼脂粉，使其终质量浓度为18 g/L。

LB液体培养基：蛋白胨5.0 g、NaCl 5.0 g、牛肉浸膏2.50 g，加蒸馏水至500 mL，pH值 7.0左右，121 ℃灭菌20 min。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉，使其终质量浓度为18 g/L。

1.1.3 仪器设备 HYG 旋式恒温调速摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)，HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，DL-5 低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)，TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，PCR 扩增仪(BioRad,USA)，电泳仪、电泳槽(DYY-2C型)(北京市六一仪器厂)，凝胶成像分析系统CDS8000(上海培清科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 解磷菌的筛选

1.2.1.1 初筛 称取5 g土样放入盛有 45 mL灭菌生理盐水的锥形瓶中，置摇床上100 r/min振荡15 min，静置，采用梯度稀释法将上清液分别稀释至10-3、10-4、10-5三个稀释度，取0.1 mL稀释液涂布至筛选平板，倒置于30 ℃培养箱中培养2～4 d，观察透明圈产生情况。解磷圈直径(H)、菌落生长直径(C)的比值(H/C)越大，表示解磷菌解磷能力越强，以此初步测定菌株降解无机磷的能力[25]。

1.2.1.2 复筛 测解磷圈大小只是定性检测菌株的解磷特性，解磷菌解磷能力的衡量还需结合定量法，通过测定上清液中磷的质量浓度来确定菌株解磷能力的强弱。将初筛菌株接种于 LB液体培养基中，于30 ℃、150 r/min恒温振荡器中培养24 h，得种子液。再将种子液以1%接种量接入无机磷液体培养基中，以不接菌的培养基为对照，于30 ℃、150 r/min恒温振荡器中培养0～5 d。8 000 r/min 离心 15 min，采用磷钼蓝比色法测定上清中的磷含量[26]。

1.2.2 解磷菌的鉴定

1.2.2.1 形态特征鉴定 将菌株划线接种于LB平板，于30 ℃恒温培养箱中培养1～2 d，观察单菌落的形态特征，另取新鲜培养物进行革兰氏染色，观察其显微形态。

1.2.2.2 生理生化特性鉴定 生理生化试验参照文献[27-28]的方法进行。

1.2.2.3 分子生物学鉴定 按照文献[29]的方法提取解磷菌基因组DNA，采用细菌16S rDNA通用引物[30]进行PCR扩增。上游引物27F序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R序列为5′-GGCTACCTTGTTACGACT-3′。反应体系为DNA 1 μL、10×EasyTaqbuffer 2.5 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL、高纯dNTP 2 μL，加双蒸水至总体积为25 μL。扩增的反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环30 次；72 ℃ 10 min。

PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工(上海)生物工程股份有限公司测序，所得序列提交至GenBank数据库，利用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)与已有细菌的16S rDNA序列比对；同时，将序列提交到EzBioCloud数据库，进行同源性搜索，找出与所得基因序列同源性最高的已知菌种，同时，提取部分与所测菌株的16S rDNA序列同源性较高的已知菌株的16S rDNA序列，利用ClustalX 1.83软件进行序列多重比对，利用MEGA 6.0软件采用Neighbor-joining法构建系统发育树(自展值为1 000)，鉴定解磷菌与已知菌株的同源性。

1.2.3 解磷菌的生长特性

1.2.3.1 解磷菌生长曲线 将解磷菌接入盛有120 mL基础培养基的250 mL锥形瓶中，并设无菌对照，置摇床中30 ℃、150 r/min培养，每隔2 h取样测定OD600值。以时间为横坐标、OD600为纵坐标，绘制解磷菌的生长曲线。

1.2.3.2 温度对解磷菌生长的影响 将种子液以1%的接种量接入LB液体培养基中，分别置于18、20、26、28、30、32、34、37、40、42 ℃下，于摇床中150 r/min培养48 h，以不接菌的培养基为对照，测定菌悬液的OD600值。

1.2.3.3 pH值对解磷菌生长的影响 将种子液以1%的接种量接入pH值分别为4.5、5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液体培养基中，于摇床中150 r/min培养48 h，以不接菌的培养基为对照，测定菌悬液的OD600值。

1.2.3.4 NaCl质量浓度对解磷菌生长的影响 将种子液以1%的接种量接入NaCl质量浓度分别为0、5、10、20、30、40、50、60、70 g/L的LB液体培养基中，于摇床中150 r/min培养48 h，以不接菌的培养基为对照，测定菌悬液的OD600值。

2 结果与分析

2.1 牛蒡根际土壤中解磷菌的筛选

2.1.1 初筛 将不同稀释度的土壤菌悬液涂布在筛选培养基上进行初步筛选，共获得产解磷圈明显、H/C值介于1.1～1.5的菌株48株，其中，JL-1长势良好，所产解磷圈最明显，经测量，其H/C值为1.5(图1)。

图1 初筛所得菌株产生的解磷圈

2.1.2 复筛 将初筛所得48株菌进行液体发酵，经测定发现，发酵液上清中的磷含量介于26.84～49.56 μg/mL。其中，JL-1的解磷量最高，为49.56 μg/mL，进一步测定其动态解磷过程，结果如图2所示。由图2可知，菌株JL-1具有较强的解磷能力，且解磷速度较快，2 d后解磷量达到峰值，为50.4 μg/mL，之后略有下降，这可能是由于在发酵初期培养基养分充足，菌体呈指数增长，能快速分解磷酸钙；而后随着营养的耗尽，微生物活性下降,其中的可溶性磷有可能和发酵液中的金属离子等结合,成为不溶态,导致解磷总量下降[31]。

图2 菌株JL-1的解磷进程

2.2 牛蒡根际土壤中解磷菌株JL-1的鉴定

2.2.1 形态特征鉴定 菌株JL-1的菌落形态特征为：淡黄色，略微凸起，边缘不整齐，菌落较为湿润；革兰氏染色呈阴性，菌体呈杆状(图3)。

图3 菌株JL-1的单菌落形态(左)及细胞形态(右)

2.2.2 生理生化特性鉴定 由表1可知，菌株JL-1的葡萄糖产酸、淀粉水解、甲基红、接触酶、明胶液化、柠檬酸盐利用试验均呈阳性，VP、氧化酶、吲哚、H2S产生、脲酶、硝酸盐还原试验均呈阴性。

表1 菌株JL-1的生理生化特性

注：+表示阳性，-表示阴性。

2.2.3 分子生物学鉴定 以菌株JL-1基因组DNA为模板，PCR扩增JL-1的16S rDNA序列，经电泳可见，在1 200～1 500 bp处出现清晰条带(图4)。

经测序，该序列全长为1 337 bp(图5)。

图4 16s rDNA PCR扩增产物

图5 JL-1菌株的16S rDNA序列

将测序得到的序列利用BLAST进行比对，同时，将此序列提交到EzBioCloud数据库，进行序列同源性比对，结果显示，该菌株与不动杆菌属(Acinetobacter)的菌株呈高度同源性，表明此菌株属于不动杆菌属，与此菌株同源性最高的为Acinetobacterindicus，相似性为100% ，选取同源性较高的菌株的16S rDNA序列构建系统发育树(图6)，结果发现，JL-1与AcinetobacterindicusCIP 110367 K1530754聚在一起，自展值为100，表现出较近的亲缘关系。结合之前的形态特征、生理生化特性以及16S rDNA比对结果，最终确定该菌株为Acinetobacterindicus。将此菌株的16S rDNA序列提交至NCBI 的GenBank数据库，获得登录号为MF497336。

图6 基于16S rDNA序列构建的系统发育树

2.3 牛蒡根际土壤中解磷菌株JL-1的生长特性

2.3.1 解磷菌株JL-1的生长曲线 菌株JL-1的生长曲线如图7所示，菌株生长迅速，延滞期很短，2 h后即进入对数期，12 h后进入稳定期，22 h后进入衰亡期，当菌体处于对数中后期时，细胞生长迅速，代谢旺盛，此时期的菌体适于作为种子液以利于后续的扩培。

图7 菌株JL-1的生长曲线

2.3.2 温度对解磷菌株JL-1生长的影响 菌株JL-1在不同温度下的生长情况见图8，可以看出，菌株可生长的温度范围较宽，在20～40 ℃条件下皆可生长，且随着温度的升高，菌体量呈现先增加后下降的趋势。其中，在 26～37 ℃条件下，菌体量较高，说明此温度范围有利于菌株的生长；菌株的最适生长温度为30 ℃。

图8 温度对菌株JL-1生长的影响

2.3.3 pH值对解磷菌株JL-1生长的影响 由图9可知，pH值低于4.5或高于9.0时，菌株无法生长，在pH值4.5～9.0时，随着pH值的升高，OD600值呈现先升高后降低的趋势。菌株较适生长的pH值为6.5～8.0，最适生长pH值为7.0。

图9 pH值对菌株JL-1生长的影响

2.3.4 NaCl质量浓度对解磷菌株JL-1生长的影响 由图10可以看出，当NaCl质量浓度在0～10 g/L时，菌体量呈升高趋势，可见较低的NaCl质量浓度能够促进菌株的生长；当NaCl质量浓度继续增大时，菌体生长逐渐受到抑制，当质量浓度大于60 g/L时，菌株几乎不生长。可见，菌株可以耐受NaCl质量浓度为60 g/L，最适合其生长的NaCl质量浓度为10 g/L。

图10 NaCl质量浓度对菌株JL-1生长的影响

3 结论与讨论

本研究从土壤中筛选获得1株具有较好解磷效果的细菌，经形态学观察、生理生化及分子生物学鉴定，确定该菌株为不动杆菌属(Acinetobacter)中的Acinetobacterindicus。不动杆菌属细菌在自然界广泛存在，目前，不动杆菌属中已经被正式命名的共有37 个种[32]，其可以在潮湿和干燥的表面生存，是重要的土壤微生物，具有代谢多样性，可以降解己内酰胺、除草剂、农药、石油烃组分等，但尚未见Acinetobacterindicus降解磷的报道。因此，本试验筛选所得AcinetobacterindicusJL-1从一定程度上丰富了野生解磷菌资源。

土壤重要的理化指标有酸碱度、温度、盐度等。土壤环境复杂，具有较大的温度、酸碱度、盐度变化等特征[33]。对AcinetobacterindicusJL-1的生长特性研究表明，该菌株生长较快,在温度26～37 ℃、pH值6.5～8.0条件下，生长较好，最适温度为30℃，最适pH值为7.0；可以耐受NaCl质量浓度为60 g/L，生长最适NaCl质量浓度为10 g/L。综上，该菌株可以在较复杂的环境条件下生长，具有较好的应用前景。