RVP Fast与Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay联合诊断呼吸道感染病原体

戴 蕾，郑齐锶，东 芳，宁明哲

(南京大学医学院附属鼓楼医院 检验科，江苏 南京210008)

呼吸道感染(RI) 是临床常见疾病之一，近年来，随着大气环境的改变，雾霾天气的增多，社会老龄化程度加剧，呼吸道感染的病例呈逐年上升趋势。其临床症状差异不明显，而引起呼吸道感染的病原体很多，明确诊断病原体，合理用药，针对性治疗，才能避免抗生素的滥用和疾病的延误[1]。传统检测呼吸道病原体检测方法如细菌培养、病毒培养、免疫荧光和抗原检测，存在实验周期长、操作复杂或敏感度低等缺点。某些难以培养的细菌，如军团菌、百日咳等，在日常检测中基本处于检测盲区。本研究收集了我院呼吸道感染患者的咽拭子标本67份，分别应用xTAG呼吸道病毒群快速检测(RVP Fast)与Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay 进行病原体检测，明确诊断病原体，为临床合理用药提供一定的依据。

1 材料与方法

1．1材料咽拭子标本来源于我院门诊2015年3月至10月在我院呼吸科门诊诊断为呼吸道感染的患者，共67份。其中，男性患者36人，女性患者31人，年龄21-92岁。

1.2仪器与试剂2720 Thermal Cycler PCR扩增仪(美国ABI公司) ，Luminex xMAP 200IS 仪(美国Luminex 公司)，电泳仪(美国bio-rad公司)，UTM(Universal Transport Media) 病毒采集和保存体系(意大利COPAN 公司) ，RNA 和DNA 提取试剂盒(德国Qiagen 公司) ，xTAG RVP Fast(加拿大Luminex公司) ，Seeplex PneumoBacter ACE Detection试剂盒，琼脂糖为BIOWEST REGULAR GAROSE G-10。

1.3RNA与DNA提取使用Qiagen公司核酸提取试剂盒。

1.4RVPFast检测按照试剂盒说明书及文献[2,3]报道，先PCR扩增19个亚型的呼吸道病毒基因，将扩增产物与标记特异探针的磁珠混合液杂交，杂交产物在xMAP 200IS 仪器上检测荧光信号强度中位数值(MFI) ，应用配套软件分析检测结果。检测设空白对照以确认是否污染，设置lambda 噬菌体为阳性质控，噬菌体MS2 RNA 为内参照。

1.5SeeplexPneumoBacterACEDetectionassay检测按照试剂盒说明书配置反应体系：5× PB ACE PM 4 μl，2× Multiplex Master Mix 10 μl，8-MOP Solution 3 μl，DNA模板 3 μl，共20 μl。反应条件：94℃，15 min；94℃，30 s，60℃ 90 s，72℃ 90 s，40个循环；72℃ 15 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯照射成像，根据产物位置判断病原体类型。

2 结果

2.1RVP Fast共检测标本67份，阳性标本4例，阳性率为5.97%，其中肠鼻病毒2例，流感A型病毒1例，呼吸道合胞病毒(RSV)1例。见表1。

表1 检出病毒标本详细列表

2.2Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay检测标本67份，阳性标本26份，阳性率38.81%。其中，单病原体感染者14名，男10名，女4名；双病原体感染者12名，男5名，女7名。检出肺炎链球菌7例，流感嗜血杆菌8例，肺炎支原体5例，肺炎衣原体9例，百日咳鲍特杆菌4例，军团菌5例。见表2及图1。

表2 检出的病原体分布

注：泳道7为 PB ACE MARKER。泳道1、2、4、5、11为肺炎链球菌阳性，泳道9为流感嗜血杆菌阳性，泳道12为肺炎衣原体阳性

图1PCR产物(Seeplexace试剂盒)电泳图

3 讨论

成人呼吸道感染的病原体检测日益受到国内外学者的重视。尤其近年来由于雾霾天气日益增多，大气环境的改变，成人呼吸道感染患者逐步增加。而且各类抗生素的广泛应用，细菌感染发生率有所降低，使得由病毒和非典型性病原体(肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌) 引起的肺炎和支气管炎相对突出。呼吸道病原体致病性强、传播快、起病急，人群不易形成持久抵抗力，临床特征缺乏特异性，容易造成抗生素的滥用，给疾病的诊治及防控造成一定的困难[5]，(肺炎支原体、肺炎衣原体和嗜肺军团菌) 引起的肺炎和支气管炎相对突出。呼吸道病原体致病性强、传播快、起病急，人群不易形成持久抵抗力，临床特征缺乏特异性，容易造成抗生素的滥用，给疾病的诊治及防控造成一定的困难[5]，且呼吸道病原体在不同的季节、不同地区和不同人群中流行性也不尽相同[6]。因此对本地区成人呼吸道感染的病原学和流行病学调查和研究显得尤为重要。

xTAG=呼吸道病毒群快速检测(RespiratoryViral Panel RVP Fast Array，RVP Fast) 为代表的液相多重检测技术能在同一反应体系同时检测流感病毒(甲、乙型，甲型H1、H3 亚型及未知亚型) ，呼吸道合胞病毒(A、B 型) ，冠状病毒(OC43 亚型、NL63 亚型、229E 亚型和HUK1 亚型) ，副流感病毒(1-4型) ，人类偏肺病毒，肠道/鼻病毒，腺病毒和人博卡病毒共8 个种属19 个型别。有关研究评估了RVP Fast 方法筛查呼吸道病毒的效能[2,3,6]，但国内目前尚未在临床实验室推广。本研究中，67份标本检测阳性率为5.97%，低于文献报道的20.9%-35.4%。但两种研究方法不同，本研究应用的为PCR后流式荧光免疫分析技术，而文献6中使用的为德国欧蒙公司的间接免疫荧光(IIF)法，且本研究例数较少，而且操作相对繁琐，干扰因素多，对结果有一定的影响。因此，本法暂仅用于临床研究，不适合在医院推广。

Seeplex PneumoBacter ACE Detection assay一次检测七种非典型肺炎的病原体，包括肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、百日咳鲍特杆菌、流感嗜血杆菌。相比于RVP Fast检测，此方法耗时少，且阳性率高。普通PCR也可检测此类病原体，但一次仅能检测一种病原体，此方法可一次检测六种病原体，提高检出率，帮助临床明确诊断。细菌培养可检出肺炎链球菌、流感嗜血杆菌，但其为苛养菌，形态与正常菌群相似，不易分辨，检出率低。此技术的推广，可提高此两种病原体的检出率，耗时较细菌培养短。目前，大多数医院微生物室均不能培养嗜肺军团菌、百日咳鲍特杆菌，使得这两种细菌的诊断处于盲区。此技术的使用与推广，为临床提供明确的诊断，合理使用抗生素提供依据。