早老素1基因circRNA在阿尔茨海默病中的表达

胡国艳，杨 欣，徐 鹏，许 莹，林裕龙，罗新妮，钟笑梅

(1.广州医科大学附属第五医院 a.检验科;b.药学部，广东 广州510000；2.广州市惠爱医院(广州医科大学附属脑科医院)a.检验科;b.神经内科)

环状RNA(circular RNA,circRNA)是新近发现的一类共价键闭合环状RNA分子。尽管早在1970年RNA病毒中就发现circRNA的存在[1,2]，但随后的30年仅发现少数几个环状RNA，因其表达水平低被认为只是特定表达或RNA异常剪接的产物，并未受到重视，研究进展缓慢。随着高通量测序技术和生物信息学的发展，人们在真核细胞发现了大量circRNA[3]，且某些circRNA可以发挥竞争性内源RNA的作用来调控基因表达，还可以作为miRNA海绵来影响基因的调控和表达[4-6]。circRNA由于形成闭合的环状，在生物体内非常的稳定[4,7]，因此，其有可能成为一种良好的生物标志物。

阿尔茨海默病(AD)是伴有常染色体缺陷和神经元丧失的神经退行性病变，发病机制尚不明确。目前认为γ-分泌酶是导致AD的关键因素之一[8]，γ-分泌酶是由四个膜整合蛋白组成的包含19次跨膜螺旋的复合体，包括PS1、Aph-1、Pen-2和Nicastrin四个亚基，主要参与β-淀粉样蛋白前体(APP)和Notch等重要跨膜蛋白的切割和水解过程，其中早老素基因PSEN1(Presenilin 1,PS1)是执行酶活性功能的膜整合蛋白酶活性亚基，为该酶的催化亚单位[9-12]。

前期研究表明circRNA大多是由外显子参与环化[6]；我们推测PS1也有可能存在circRNA。对PS1基因的全长RNA 序列进行分析，PS1(基因登录号NM_000021.3)mRNA 由12个外显子组成；本研究针对12个外显子分别设计反向PCR引物，来扩增可能存在的circRNA；通过这种方法，我们在人神经母细胞瘤SY5Y细胞系发现了由PS1 mRNA的第2、3、4、5外显子环化而成的circRNA，此circRNA全长序列为615个核苷酸，我们将其命名为Cir-PS1-615。并建立了Cir-PS1-615的检测方法，对AD患者与对照组血液进行了检测。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂ABI7500 实时荧光PCR仪(Life公司)，PMD18-TA克隆载体(TAKARA公司)，TRIzol○RReagent(Life公司)，Nucleic Acid Stain 核酸染料(北京鼎国昌盛)，NormalRunTM250 bp-II DNA ladder(上海捷瑞)，全自动凝胶成像分析系统(上海培清)，HiScript○RII 1st Strand cDNA 合成试剂盒(Vazyme)，AceQ○RqPCR SYBR○RGreen Master Mix(Vazyme)。

1.2研究对象研究对象经1名神经科副高或以上医师及1名精神科副高或以上医师诊断一致方纳入研究。AD组：从本院神经内科、老年精神科住院的AD患者收集共30例，其中男16例，女14例，年龄60-90岁。入组标准：(1)简易精神状态检查(Mini Mental State Examination，MMSE)评分文盲≤ 17分，小学文化≤ 20分，初中及以上文化≤24分。(2)符合DSM-Ⅳ痴呆诊断标准。(3)符合美国神经病学、语言障碍和中风研究所及阿尔茨海默病与相关障碍协会(NINCDS-ADRDA)1984年修订的“很可能AD”的诊断标准。(4)无甲状腺功能低下、叶酸缺乏、维生素B12缺乏、物质滥用和感染等其它原因导致的痴呆病史。(5)头颅MRI检查排除血管性痴呆及肿瘤、脑积水等其它神经系统疾病导致的痴呆。正常对照(Normal Control，NC)组：从社区老人中招募，共30例，年龄50-74岁，其中男15例，女15例。入组标准：(1)无认知障碍主诉。(2)无神经或精神疾病史，无痴呆家族史。(3)MMSE评分文盲>17分，小学文化>20分，初中及以上文化>24分。(4)CDR=0分。(5)头颅MRI检查无明显异常。入组者均签署了知情同意书，并经本院伦理委员会批准。

1.3细胞培养SH-SY5Y(ATCC Number:CRL-2266)细胞于含10%胎牛血清(GIBCO)DMEM培养液中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养。

1.4TA克隆和测序根据PS1基因的RNA(登录号：NM_000021.3)序列设计12对反向PCR扩增引物，引物序列参见表1，提取SH-SY5Y细胞的总RNA ，然后用random 逆转录引物合成 cDNA，反向PCR扩增PS1的外显子序列，2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，将PCR产物克隆到PMD18-TA克隆载体中，然后DNA测序鉴定。

表1 PCR引物序列

1.5RT-qPCR对入组患者抽取EDTA-K2抗凝血，按试剂说明书提取标本总RNA，反转录成cDNA，然后对样本进行Cir-PS1-615检测，同时检测PS1mRNA，每个样本重复检测3次。内参为actin，引物序列及产物见表2。反应体系为10 μl ，AceQ○RqPCR SYBR○RGreen Master Mix 5 μl，Forward primer (10 μM) 0.2 μl，Reverse primer (10 μM) 0.2 μl，50x ROX Reference Dye 2 0.2 μl，模板DNA 2 μl，灭菌蒸馏水加至10 μl。反应条件为95℃ 5 min预变性；95℃ 10sec，60℃ 34sec，40个循环，每个循环结束时收集荧光；再加入熔解曲线：95℃ 15sec，60℃ 60sec，95℃ 15sec。根据2-△△C t公式计算目标基因相对表达情况。

表2 PS1 circRNA-615 and mRNA PCR检测引物序列

2 结果

2.1TA克隆和测序结果分别针对PS1基因12个外显子设计反向PCR扩增引物(图1A)，扩增结果显示PS1基因的 第2,3,4,5有明显的扩增产物，扩增大小约600 bp(图1B)；将PCR产物连接到TA克隆载体上进行DNA序列测定，比对分析后发现PS1基因的第2和第5外显子首尾连接环化(图1C、D)，PS1基因参与形成PS1-circRNA的长度为615 bp，将此circRNA命名为Cir-PS1-615 (图1E)。

(A) Construction Chart of PS1 mRNA (Accession No.NM_000021),design of RT-PCR primers for each exon;(B) Agarose electrophoretogram for PCR products,significant amplification product is found in Electrophoresis Channel 2-5.M:Marker DL2000;(C) Results of TA cloning and sequencing for PCR product,with the arrow indicating connected sites for PS1 cyclization;(D,E) PS1 Exon 2-5 involved in the cyclization to generate circRNA-PS1,among which,Exon2:82 bp,Exon3:140 bp,Exon4:251 bp,Exon5:142 bp.circRNA-PS1 consists of 615 nucleotides.

2.2Cir-PS1-615在AD中的表达特异性检测Cir-PS1-615，上游引物跨越环化位点，扩增大小176 bp(图2A)；线性 PS1 mRNA的检测引物扩增大小111 bp(图2B)；通过对临床AD患者的血液标本进行PT-QPCR基因表达检测，结果显示Cir-PS1-615 在AD患者中表达量普遍下降(n=30，P<0.05)(图2C)；线性的 PS1 mRNA 在AD 患者中表达量升高(图2D)；Cir-PS1-615和线性的 RNA 比例成负相关。

(A) PCR primer testing PS1 circular RNA,spanning cyclization binding sites,amplified size of 176 bp；(B) PCR primers testing PS1 linear RNA,spanning exons 8 and 9,amplified size of 111 bp；(C,D) RT-QPCR detection of expression differences between PS1 circular RNA and linear RNA in the AD patients and control groups.

3 讨论

我们的结果显示人PS1基因客观存在一种环状RNA，且在AD患者中Cir-PS1-615表达明显降低，和线性的PS1 mRNA表达呈现负相关。本研究样本量有限，还需要进行大样本的验证。在本文发出时，我们查阅到circBase里已经有了PS1环状RNA的资料，也有一个615 bp的环状RNA，经比对，正是我们检测到的Cir-PS1-615。

目前对于circRNA的具体功能尚未明确，只有几种假定的说法：1) circRNA可以作为“sponge”海绵吸附miRNA ，抑制其功能[13]；2) circRNA通过碱基互补配对直接调控其他RNA水平[5]；3) circRNA能与蛋白质结合,抑制蛋白质活性、募集蛋白质复合体的组分或调控蛋白质的活性[14]；4) circRNA也可作为翻译的模板指导蛋白质的合成[15,16]。对于PS1 蛋白的生物学功能研究比较多，有大量文章报道PS1基因的突变与AD密切关联[17-19]，PS1作为 γ-分泌酶的重要组分参与APP的代谢途径，还参与Notch通路和Wnt信号通路等[20-23]，那么Cir-PS1-615是否和AD疾病有关联？ Cir-PS1-615在AD疾病和对照中有表达性差异，我们推测Cir-PS1-615在AD疾病发生发展过程中有重要的生物学功能。Cir-PS1-615发挥生物学功能是通过哪一种方式？为什么其表达量和线性的PS1 mRNA 呈现负相关？这是我们以后要解决的问题。目前对于Cir-PS1-615产生环化的具体机制还不清楚，最近有研究报道RNA结合蛋白QKI能特异性结合基因的内含子中，促进circRNA的产生，在EMT过程中circRNA可能扮演重要角色[24]；虽然通过高通量测序结合生物信息学分析提示在生物体内客观存在大量circRNA，但是大部分circRNA的功能还是未知。人们开展circRNA的生物学功能及其在人类疾病发生、发展中作用的研究才刚刚起步，因此对于circRNA有待我们更多的探索。

本课题组研究发现了AD密切关联基因PS1的一种RNA环化现象，此circRNA的发现为进一步明确PS1基因的生理学功能打下基础。circRNA由于其形成封闭的环状，在细胞内外可以很稳定的存在，且可以在血液循环中流动，我们通过临床AD患者的血液标本PT-QPCR检测发现，Cir-PS1-615 在AD中表达明显降低，因此Cir-PS1-615有可能成为更加理想的检测阿尔茨海默的早期临床诊断指标。对Cir-PS1-615生理学功能的研究，可以为以后开发预防治疗阿尔茨海默的靶点药物打下基础。