GDNF在成人脂肪基质细胞向星形胶质细胞分化中的作用

欧 亚，元小冬，张丽丽

(华北理工大学附属开滦总医院，河北 唐山063000)

神经干细胞的发现打破了神经元不能再生的传统观念。目前研究资料表明，脂肪间充质干细胞(ADSC)是一种具有多向分化潜能的干细胞，它不仅可以在体外分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞等中胚层来源的细胞，而且还可以横向分化为神经细胞和神经胶质细胞，成为研究神经系统退行性疾病的靶向细胞[1,2]。而作为中枢神经系统胶质细胞中数量最多、体积最大的星形胶质细胞，其分泌的神经营养因子等活性物质在脑内广泛分布，对神经细胞有一定的营养作用，在保护神经细胞、促进轴突生长、神经损伤修复和维持正常的脑功能中有重要意义[3,4]。其中，胶质源性神经营养因子(GDNF)作为GDNF家族中首次被发现的神经营养因子，在多种胶质细胞中，尤其是星形胶质细胞中充分表达[5]。其神经营养活性较高，不仅可以在保护多巴胺运动神经元方面发挥作用，同时，对于中枢及外周的运动、感觉、交感神经元等具有同等的营养作用。本研究通过对诱导过程中星形胶质细胞的GDNF检测，探讨在此过程中形成的星形胶质细胞是否具有神经营养功能，以及GDNF对诱导过程所起到的作用。

1 材料与方法

1.1实验取材本研究所用的脂肪组织为华北理工大学附属开滦总医院美容整形中心和唐山金荣整形美容医院健康成人腹部皮下吸脂整形术后的脂肪组织废弃物。此项研究经志愿者同意并经华北理工大学伦理委员会批准。

1.2ADSC的体外提取、培养脂肪组织取材后，应用Ye等人[6]的方法，将细胞置于恒温培养箱中进行培养。随后每3天换液1次，大约在10-14天细胞长满瓶底，按照1∶2比例进行传代，之后继续应用培养液进行培养。

1.3ADSC向星形胶质细胞诱导分化收集生长状态良好的第3-6代ADSC，制成细胞爬片，待细胞生长至70%左右融合时，开始应用以IBMX为主要成分的化学诱导剂进行诱导分化[7]，依据诱导分化反应时间分别分为诱导48 h组、诱导7 d组、诱导14 d组、诱导 21 d组。同时，选取按常规培养无诱导剂的未诱导细胞作为对照组。

1.4光学显微镜及透射电子显微镜下观察诱导后细胞形态倒置相差显微镜下观察未诱导及诱导48 h、7 d、1 4d和21 d时的细胞形态并摄片。消化、离心收集诱导分化48 h的成人ADSC。3%戊二醛、1%饿酸固定，丙醛脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，2%醋酸铀和枸橼酸铅染色，透射电镜下观察细胞超微结构、拍照记录。未诱导的ADSC作为对照。

1.5免疫荧光细胞化学染色法检测GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共表达取未诱导及诱导后48 h、7 d、14 d、21 d细胞制作爬片，行免疫荧光GFAP、GDNF染色及GFAP和GDNF共染色。一抗分别为鼠抗人GFAP单克隆抗体、兔抗人GDNF多克隆抗体及二者的混合工作液。操作按试剂盒说明书进行。荧光显微镜下观察并摄片。GFAP染色阳性细胞胞质为棕黄色，GDNF染色阳性细胞胞质为绿色，GFAP/GDNF共染色阳性细胞胞质为黄色。计算GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色阳性细胞百分比。

1.6统计学方法所有实验数据通过Excel 2003 建立数据库，采用SPSS13.0统计软件包进行统计，所得数据以均数±标准差表示，同一组内不同时间点间的比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1成人ADSC的原代及传代培养

刚提取的成人ADSC呈类圆形、黑点状，于体外培养24 h内开始贴壁，而未贴壁细胞为圆形亮点状，之后随逐渐换液脱离培养瓶。贴壁细胞随培养时间延长逐渐伸展，由圆形、类圆形逐渐伸展为短梭形或多角形，胞核居中，可见1-2个核仁(图1a)。培养48 h时，多数ADSC胞体变为长梭形，呈类似于成纤维细胞样形态。7-10 d左右细胞增殖速度加快，镜下可见大量梭形细胞呈漩涡状排列，细胞生长到14 d可达到90%融合。传代后12 h内细胞基本贴壁，24 h呈成纤维细胞样形态。传至第3-6代时，细胞形态基本均匀，呈长梭形(图1b)，杂质细胞基本去除，此时细胞增生活跃，3-6天即可铺满整个瓶底。

2.2ADSC诱导过程中细胞形态学变化

诱导至5 h时，ADSC形态逐渐开始发生变化，胞体折光性逐渐增强，胞质以胞核为中心向内回缩，ADSC的原始外部胞膜轮廓逐渐模糊。16 h左右细胞胞体折光性显著增强，呈圆形或多边形，胞浆回缩更为明显。低倍镜下可见细胞伸出多条突起，但高倍镜下发现细胞这些突起为胞浆不均匀回缩所致，且某些细胞仍能看到ADSC细胞膜的原始外部轮廓(图2a)。48 h，光镜下可见典型的星形胶质细胞形态，即胞体圆形，伸出多条细长突起，部分一级突起伸出多条次级突起，胞核圆形，居中，可见到1-2个核仁，但部分细胞的突起末端分化不完全(图2b)。此后至诱导后14 d，细胞形态基本保持不变(图2c)。21 d时，胞体折光性减弱，呈三角形或不规则形，部分突起回缩，仅有2-3条较短突起。28 d时，大量细胞脱落、死亡。

图a为原代培养3 d时细胞，贴壁细胞呈黑点状；b为成人ADSC传代至第3代3 d时，成纤维细胞样形态，并呈旋涡状生长。

图1成人ADSC原代及传代培养后倒置相差显微镜下的细胞形态变化特征

图a箭头所示为未分化完全细胞；图b为诱导后48h细胞；图c为诱导后14 d细胞。

2.3成人ADSC在诱导后的超微结构变化

透射电镜下可见，经化学诱导后的星形胶质细胞胞体基本呈圆形或椭圆形，表面有较多突起；核呈卵圆形(图3a)，具有1-2个核仁，常染色质多，异染色质少；胞质中可见较多核糖体及溶酶体，有大量交错排列的胶质原纤维(图3b)。

2.4诱导后细胞GFAP、GDNF免疫荧光表达

未诱导ADSC无GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色阳性细胞。诱导后开始出现GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色阳性细胞，且GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色阳性细胞百分比随诱导时间延长逐渐升高，诱导7 d时GFAP/GDNF共染色阳性细胞百分比达到峰值(P<0.05)，诱导14 d时GFAP、GDNF染色阳性细胞百分比达到峰值(P<0.05)，之后逐渐下降。相同时间点比较，GFAP阳性细胞百分比>GDNF阳性细胞百分比>FAP/GDNF共染色阳性细胞百分比，P<0.05。见表1。

图b箭头所示为星形胶质细胞中的胶质原纤维结构。

图(a1)-(e4)分别为未诱导组、诱导48h、7d、14d和21d组细胞GFAP、GDNF和GFAP/GDNF的表达结果。绿色为GFAP阳性表达部位，红色为GDNF阳性表达部位，蓝色细胞核，黄色为GFAP和GDNF阳性共表达部位。

图4ADSC诱导后GFAP、GDNF免疫荧光表达

表1 诱导过程中各时间点细胞GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色阳性细胞百分比

注：各组之间GFAP阳性率均有统计学差异(P<0.05)，各组之间GDNF阳性率均有统计学差异(P<0.05)，各组之间GFAP/GDNF共表达率均有统计学差异(P<0.05)。诱导48 h组的GFAP/GDNF共表达率小于该组的GFAP表达阳性率和GDNF表达阳性率，且均有统计学差异(P<0.05)；诱导7 d、14 d和21 d组的细胞同样存在此种现象。

3 讨论

以阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)为代表的神经退行性疾病是目前严重影响人类生存和生活质量的一大类常见疾病。而神经干细胞的发现打破了神经元不能再生的传统观念。国内外有研究者已将ADSC成功诱导分化为神经元和星形胶质细胞等各种神经细胞[8-14]。

星形胶质细胞是胶质细胞中数量最多、具有重要功能的细胞，可以通过分泌多种神经因子来实现对神经元的营养修复作用。星形胶质细胞分泌的神经营养因子等活性物质在脑内广泛分布，对神经细胞有一定的营养作用，在保护神经细胞、促进轴突生长、神经损伤修复和维持正常的脑功能中有重要意义。星形胶质细胞可分泌的多种神经营养物质，包括胶质源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)等。其中GDNF是众多学者研究最多的神经营养因子之一，该种神经因子在中枢神经系统中分布广泛,在个体的整个发育期都有广泛的表达。GDNF因来源于神经胶质细胞，且最早由Lin等[15]从大鼠胶质细胞B49的条件培养液中分离出来，故被命名为胶质细胞源性神经营养因子。有研究表明，GDNF可以促进骨髓基质干细胞向神经细胞转化，可以增强内源性神经干细胞增殖和分化[16,17]。我们的实验研究发现，由ADSC诱导分化而来的星形胶质细胞随诱导时间的延长，GFAP、GDNF及GFAP/GDNF共染色阳性细胞百分比逐渐升高，诱导7 d时GFAP/GDNF共染色阳性细胞百分比达到峰值，说明此时分化成功的星形胶质细胞最具功能代表性，同时不断分泌GDNF，此后在相对于初始诱导剂的诱导环境中，GDNF的浓度明显增高，我们推测这又间接促使ADSC向星形胶质细胞分化。诱导14 d时GFAP、GDNF染色阳性细胞百分比达到高峰，即在不断新生星形胶质细胞的同时，GDNF也逐渐增高，二者互相影响，直至14 d后二者比例下降。但有报道显示，GDNF可以部分抑制细胞周期蛋白，从而阻止细胞增生进程[18]，这是否是导致减少诱导14 d后星形胶质细胞数量的原因目前还不得而知。