高脂饲料联合链脲佐菌素诱导妊娠期糖尿病大鼠模型的优化方案

汤梦雨，徐文婷，王彩红，王利红

（张家港市中医医院生殖科，江苏苏州215600）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）指妊娠前糖代谢正常或有潜在的糖耐量减退，妊娠期才出现或发现的糖尿病，是一种常见的妊娠期疾病。目前随着诊断方式的改进以及产检的普及，GDM检出率在不断增高。国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，IFGO）指出，有大约1／6的新生儿是由GDM母亲分娩的［1］。研究表明GDM易导致巨大儿、难产和产道损伤，增加剖宫产率，且GDM患者羊水过多的发病率也显著高于正常女性，从而增加了胎膜早破和早产的发生率［2］。从长远看来，GDM患者产后发展为2型糖尿病的风险也比正常人高。对于GDM患者的子代，GDM患者孕期宫内高糖，体内代谢的紊乱，在胎儿发育的关键时期，持续刺激胎儿并且产生长期影响，这种影响被叫作“代谢记忆”，这种“代谢记忆”效应可使后代在成年后发生2型糖尿病以及肥胖相关的代谢综合征的概率高于正常人［3］。然而目前尚未对GDM的病因及其对子代不良影响的机制有完善的结论，研究模型局限性较大，因此建立稳定、科学的实验性GDM动物模型具有重要的意义。本研究探究建立GDM大鼠模型的优化方案，旨在为GDM的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级6周龄Wistar大鼠90只，其中雌鼠60只，雄鼠30只，体重130～161g，购自上海斯莱克实验动物有限公司。链脲佐菌素（STZ，美国Sigma公司）。40%脂肪饲料（上海普路腾生物科技有限公司），配方为普通繁殖鼠料54.6%、猪油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、预混料2.1%、麦芽糊精2.2%。

1.2 动物饲养

实验所用大鼠均饲养于通风良好，温度控制在22～26℃，相对湿度控制在40%～70%的屏障系统内，标准饮食。定期更换垫料，适应性饲养1周后，改为高脂饲料喂养，饲养8周后禁食不禁水12 h，尾尖取血测血糖，空腹血糖≥6.67 mmol／L者剔除。剔除后剩余大鼠按雌雄2∶1合笼过夜，次日早晨雌鼠阴道涂片镜检发现精子记为妊娠第1天，未孕雌鼠继续与雄鼠合笼，标记孕鼠，记录孕期。

1.3 分组与造模

所获42只孕鼠，在高脂饮食基础上，随机分为对照组10只以及 STZ不同剂量（15、25、35和45 mg／kg）造模组各8只，禁食12 h后STZ不同剂量组分别一次性腹腔注射不同剂量STZ（用0.1 mmol／L、pH为4.2的枸橼酸缓冲液配成1%的浓度），对照组注射同等剂量枸橼酸缓冲液（0.1 mol／L，pH＝4.2）。注射 STZ 3 d后测空腹血糖介于6.67～16.67 mmol／L为 GDM大鼠造模成功［3］。造模完成后继续原饲料喂养。

1.4 观察指标

1.4.1 体重 分别于STZ注射后3 d和18 d称量体重。

1.4.2 空腹血糖 分别于注射STZ前、STZ注射后3 d、7 d及18 d采集尾尖血，血糖仪检测空腹血糖。

1.4.3 成模率与死亡率 成模率＝各组造模成功孕鼠数量／各组孕鼠总数×100%；死亡率＝各组死亡孕鼠数量／各组孕鼠总数×100%。

1.4.4 孕鼠及仔鼠的一般情况 记录子鼠数量及体重。

1.4.5 组织HE染色 孕鼠25周龄处死，HE染色观察正常孕鼠及成模孕鼠肝脏组织、胰腺及脂肪细胞的变化。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 孕鼠体重的变化

各组孕鼠造模前体重差异无统计学意义。注射STZ后18 d，15 mg／kg组孕鼠体重与对照组差异无统计学意义，25、35、45 mg／kg组与对照组比较均明显减轻（均 P＜0.01）。见表1。

2.2 孕鼠空腹血糖的变化

注射STZ前各组大鼠空腹血糖水平无明显差异。对照组造模后3 d、7 d、18 d血糖与造模前相比差异无统计学意义。15 mg／kg组造模后3 d、7 d、18 d血糖与对照组相比差异无统计学意义。25 mg／kg组注射STZ 3 d、7 d、18 d后血糖与对照组相比均明显升高（P＜0.05）。注射 STZ 3 d后45 mg／kg组的空腹血糖均高于20mmol／L，注射STZ 7 d后35 mg／kg组的平均空腹血糖高于16.67 mmol／L，两组血糖均高于6.67～16.67 mmol／L的成模标准。见表2。

表1 注射STZ前后孕鼠体重的变化±s，g

表1 注射STZ前后孕鼠体重的变化±s，g

*：P＜0.01，与对照组比较

对照组10 263.7±9.5 10 317.8±28.9 54.1±9.6 STZ 15 mg／kg 8 266.8±9.0 8 303.8±9.1 37.0±4.9 25 mg／kg 8 265.9±7.9 7 293.1±7.6* 27.3±2.0 35 mg／kg 8 266.5±8.4 6 275.5±13.0* 9.0±7.1 45 mg／kg 8 263.7±15.0 3 203.0±7.2* -60.7±8.5 F值0.212 25.576 P值 ＞0.05 ＜0.01

表2 注射STZ前后孕鼠空腹血糖的变化±s，mmol／L

表2 注射STZ前后孕鼠空腹血糖的变化±s，mmol／L

*：P＜0.05，与对应天数的对照组比较

对照组 10 4.31±0.29 10 4.19±0.52 4.71±0.30 4.80±0.50 0.656 ＞0.05 STZ 15 mg／kg 8 4.09±0.51 8 4.84±0.83 5.38±1.94 4.59±0.78 1.730 ＞0.05 25 mg／kg 8 3.90±0.69 7 7.07±0.90*9.67±4.53*6.86±2.50* 6.125 ＜0.05 35 mg／kg 8 4.36±0.38 6 13.94±5.72*18.40±4.00*14.32±3.03*18.897 ＜0.01 45 mg／kg 8 4.50±0.35 3 22.37±3.65*29.70±0.52*26.57±1.46*269.777 ＜0.01 F值0.685 42.425 65.180 111.245 P值0.607 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各组的成模率及死亡率

15 mg／kg组未出现孕鼠死亡但成模率仅为12.5%，25 mg／kg组 成 模 率 最 高 且 死 亡 率 为12.5%，35 mg／kg及45 mg／kg组成模率低且死亡率均较高。见表3。

表3 成模率与死亡率

2.4 孕鼠及仔鼠一般情况

25、35及45 mg／kg组均出现了明显的“三多一少”糖尿病症状，45 mg／kg组62.5%的孕鼠死亡，并且所产仔鼠肤色呈暗紫色，活动力较差。35及45 mg／kg组所产仔鼠数量较其余3组明显减少且出现死胎、流产和巨大胎等异常发育情况。见表4。

2.5 各组大鼠肝脏、胰腺组织及脂肪细胞的变化

HE染色结果显示，成模组肝脏出现肝细胞轻度至中度脂肪变性，并伴有轻度局灶炎细胞浸润，偶见个别肝细胞变性坏死。成模组的胰腺胰岛轻度至中度萎缩，外泌腺腺泡轻度变性萎缩并伴有轻度炎细胞浸润及胰岛细胞轻度变性。成模组脂肪细胞体积轻度增大。见图1。

表4 各组所产子鼠情况

图1 大鼠肝脏、胰腺和脂肪组织病理形态（HE染色×200）

3 讨论

目前对实验型GDM大鼠模型标准的判定尚不统一，有研究使用大剂量STZ注射使模型的空腹血糖普遍高于16.67 mmol／L，但成模后导致孕鼠的死亡率、流产率、子代低体重、畸形率增高且血胰岛素水平下降［4-7］，与人类GDM的表现不符。所以本次研究选用轻度糖尿病的标准（6.67～16.67 mmol／L）作为成模标准，有利于观察GDM对母体及子代的长期影响［8］。

本次研究通过观察注射STZ前后体重及血糖的波动情况来确定最稳定的造模方式，因大鼠的妊娠期一般在21 d左右，故本次研究观察妊娠后期注射第18天的血糖及体重变化判断造模的稳定性。结果显示25 mg／kg剂量的STZ联合8周高脂饲料喂养的造模方式不仅能使血糖维持在6.67～16.67 mmol／L的轻度糖尿病水平，且成模率高，死亡率较低。而低剂量（15 mg／kg）的STZ注射组成模率过低。高剂量组（35 mg／kg、45 mg／kg）的孕鼠空腹血糖水平较高，成模率较低，并且死亡率高。HE染色显示，成模孕鼠肝脏出现肝细胞轻度至中度脂肪变性及局灶炎细胞浸润等改变，胰腺胰岛出现轻度至中度萎缩及外泌腺腺泡轻度变性萎缩等变化，脂肪细胞则出现了轻度体积增大。此次研究我们发现，适当的长时间高脂饲料喂养联合中等剂量STZ的注射不仅可以减少大剂量药物注射对大鼠机体的损害以及避免高死亡率，还可以降低血糖波动幅度，使模型稳定在较高的血糖水平，从而得到较稳定的GDM大鼠模型。

STZ是目前应用于诱导糖尿病动物模型的常用药物之一，其机制是特异性地破坏胰岛β细胞，引起胰岛素分泌功能障碍［9］。单纯使用STZ造模，血糖不易控制，与临床实际不符。研究显示，高脂可通过引起外周组织的胰岛素抵抗和胰腺β细胞合成以及分泌胰岛素的功能减退甚至衰竭，从而导致失代偿引起血糖升高［10］。高脂饲养与人类临床GDM的发病机制类似，但存在周期长、成模率低、个体差异大的缺陷。故本研究采用高脂饮食联合STZ注射的方法，不仅避免了单纯高脂饲养造模需要较长时间周期的成本，同时也可减少单纯大剂量STZ注射的不良影响。

GDM不仅会影响妇女，更会对其子代造成不利影响。高血糖与不良妊娠结局（Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome，HAPO）研究结果提出，随着妇女妊娠期血糖水平的升高，其发生早产、子痫前期、脐血C肽水平升高、新生儿低血糖、新生儿高胆红素血症、新生儿入ICU等的风险也随之升高。这种相关呈连续性，即使妊娠期血糖轻度升高，同样会对妊娠结局产生不利影响［11］。综上，本研究结果表明高脂饮食联合中等剂量STZ诱导GDM大鼠模型，造模成功率高、死亡率低。