紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤作用的影响

鲁翰林，宋盈莹，申春苹，陈晨，刘小草，冯超，卢斌峰，朱一蓓，孙中文，王雪峰

（1.苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏苏州215123；2.苏州卫生职业技术学院医学技术学院，江苏苏州215009；3.苏州大学转化医学研究院，江苏苏州215123）

细胞因子IL-1超家族成员中的IL-36γ可显著促进CD8+T、自然杀伤细胞等抗肿瘤免疫细胞的功能，抑制肿瘤生长［1］，但单一的免疫疗法往往并不能彻底抑制肿瘤生长。因此，探讨IL-36γ联合化疗药物实现对肿瘤的协同抑制作用，可推进其在肿瘤治疗中的应用。紫杉醇是临床上常用化疗药物，通常作为有丝分裂的抑制剂，直接杀伤肿瘤细胞并促使肿瘤细胞凋亡［2］。然而，紫杉醇对机体免疫功能也会产生一定的抑制作用。因此，在开展肿瘤免疫治疗的同时，如何合理有效地联合运用紫杉醇等化疗药物，值得探讨分析。

本研究拟借助IL-36γ抗肿瘤的治疗模型，在进一步分析IL-36γ对肿瘤生长抑制特点的基础上，探讨不同剂量紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤作用的影响，为采用基于IL-36γ的免疫治疗和化疗药物的联合治疗模式，从策略和方法上提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠黑色瘤B16细胞株（ATCC公司，美国）；C57BL／6J 6～8周龄雌鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司（动物合格证编号：201800310）。紫杉醇（美国Selleckchem公司）；RPMI 1640（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国 Gibco公司）；限制性内切酶、DNA标准参照物（日本TaKaRa公司）；琼脂糖（法国Biowest公司）；PCR反应试剂盒（日本TaKa-Ra公司）；氨苄西林和DH5α感受态细胞（上海生工生物工程公司）；质粒提取试剂盒（北京天根生化科技公司），Trypsin 0.05%EDTA、Lipofectamine 2000、G418（美国Thermo Fisher Scientific公司）；RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司）；逆转录试剂盒、SYBR Green试剂盒（英潍捷基贸易有限公司）；真核表达载体pCDEF3由美国匹兹堡大学Lawrence Kane实验室馈赠［1］。

1.2 基因转染细胞株的制备

设计并经金唯智生物科技有限公司合成含有人CD8信号肽序列和具有完全活性的鼠IL-36γ片段（G13至S164）编码区的融合基因片段，将其插入真核表达载体pCDEF3构建成重组表达载体pCDEF3-IL-36γ。通过Bam HⅠ和NotⅠ双酶切插入目的基因片段IL-36γ、PCR检测目的基因片段IL-36γ和基因测序对pCDEF3-IL-36γ进行鉴定。将 pCDEF3-IL-36γ用脂质体常规转染至小鼠黑色素瘤B16细胞株，加入600μg／mL的G418进行加压筛选，待存活的细胞克隆长出后采用有限稀释法进行亚克隆，将亚克隆培养后长出的细胞采用RT-qPCR鉴定目标基因IL-36γ，从而获得高表达IL-36γ的基因转染细胞株 B16-IL-36γ；同时，将空载体 pCDEF3转染B16细胞株，构建成B16-vec作为对照。进一步采用培养和细胞计数法鉴定B16-vec、B16-IL-36γ这2种转染细胞株的生长速度。

1.3 荷瘤小鼠模型的构建和分组处理

将生长至对数生长期且状态良好的B16-vec、B16-IL-36γ细胞于腹部外侧皮下接种C57BL／6小鼠，每组5只，每只小鼠注射2×105个细胞／100μL。在联合紫杉醇进行治疗的小鼠实验中，将B16-vec、B16-IL-36γ细胞按上述方法分别接种C57BL／6小鼠，每种细胞接种4组小鼠，每组5只，在第0，3，7，14，21，28天分别腹腔注射不同剂量紫杉醇溶液100 μL（紫杉醇含量为0，12.5，25，100μg）。

1.4 电子数显卡尺检测肿瘤直径并观察小鼠生存期

小鼠接种肿瘤细胞当天记为第0天，每两天采用电子数显卡尺测量小鼠肿瘤的长和宽，并计算直径。按实验动物伦理委员会审查标准，小鼠肿瘤直径超过20 mm以上即停止进一步测量和实验。按此标准，由于荷瘤小鼠中B16-IL-36γ肿瘤细胞生长速度比B16-vec细胞缓慢，其肿瘤直径的检测时间得以延长一段时间。以B16-vec为对照组，绘制两组小鼠肿瘤生长曲线。

1.5 qRT-PCR检测小鼠肿瘤组织干扰素γ（IFN-γ）mRNA的表达

分别取12.5μg和100μg紫杉醇处理过的B16-IL-36γ肿瘤组织，进行裂解并提取RNA，经逆转录合成cDNA，采用SYBR Green qPCR试剂盒，在95℃预变性5 min，95℃变性30 s和60℃退火1 min条件下进行40个循环，检测IFN-γmRNA的表达量。β-肌动蛋白上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下 游 引 物：5′-TGTAGTTTC-ATGGATGCCACAG-3′；IFN-γ上游引物：5′-CCTGCGGCCTAGCTCTGAG-3′， 下 游 引 物： 5′-GCCATGA GGAAGAGCTGCA。以 β-肌动蛋白为内参，计算2-ΔCT值。

1.6 统计学分析

数据使用GraphPad Prism 6.0统计学软件进行分析，计量资料采用非配对t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 表达IL-36γ基因转染细胞株的构建及其鉴定

成功构建了重组表达载体pCDEF3-IL-36γ。双酶切和PCR鉴定结果显示，目标基因片段成功插入了载体（图1A和图1B）。进一步的测序结果证实，所插入的目标基因片段序列正确。在此基础上将pCDEF3-IL-36γ用脂质体转染 B16细胞株，通过G418筛选、亚克隆和RT-qPCR鉴定，最终获得高表达IL-36γ的基因转染细胞株B16-IL-36γ（图C）。

图1 B16-IL-36γ基因转染细胞株的构建及鉴定

2.2 IL-36γ对肿瘤生长及荷瘤小鼠生存期的影响

肿瘤直径测量结果显示，与对照组（B16-vec）相比，B16-IL-36γ分泌表达的IL-36γ能显著抑制肿瘤的生长，在肿瘤接种的第17天，B16-vec组肿瘤直径平均为（19.15±0.70）mm，B16-IL-36γ为（7.15±0.46）mm（t＝31.98，P＜0.01）；同时，B16-IL-36γ表达的IL-36γ能显著延长荷瘤小鼠的生存期。然而，对肿瘤进一步的测量和观察表明，B16-IL-36γ肿瘤在接种的第21天后发生迅速生长，至第33天达到18.48mm，至第52天85%的小鼠死亡；同时对照组在第25天全部死亡。见图2。上述结果说明在肿瘤局部释放的IL-36γ只能在一定时间内延缓肿瘤的生长。

2.3 紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤作用及免疫应答功能的影响

联合应用紫杉醇治疗结果显示，紫杉醇对小鼠B16-vec肿瘤的生长未产生显著影响，较高剂量紫杉醇（25和100μg组）在肿瘤生长的后期明显抑制IL-36γ介导的抗肿瘤作用，而较低剂量紫杉醇（12.5μg组）则对IL-36γ介导的抗肿瘤作用产生了一定的协同效应。见图3。

RT-qPCR检测结果显示，与PBS处理的对照组比较，低剂量紫杉醇（12.5μg组）可显著促进B16-IL-36γ肿瘤中IFN-γmRNA的表达，而高剂量紫杉醇（100μg组）则明显抑制了IFN-γmRNA的表达。见图4。

图2 IL36γ对小鼠B16肿瘤直径及荷瘤小鼠生存期的影响

3 讨论

肿瘤微环境中的免疫应答往往处于被抑制状态，采用有效手段恢复、激活肿瘤中浸润淋巴细胞的活性有助于抑制肿瘤进展。细胞因子是免疫系统重要的组成部分，对免疫细胞的活化、增殖和分化具有重要的调节作用。一些白细胞介素如IL-12，IL-15和IL-21等在激活肿瘤中浸润的免疫细胞活性、抑制肿瘤进展方面具有显著效应。

IFN-γ是肿瘤免疫应答中重要的功能性指标，可上调肿瘤细胞的免疫原性，促进CD8+T、Th1等抗肿瘤免疫细胞的功能。IL-1家族成员对IFN-γ、一氧化氮合酶（NOS）、黏附分子等免疫分子的表达具有调控作用。作为IL-1家族成员，IL-36具有 IL-36α（IL-1F6）、IL-36β（IL-1F8）和 IL-36γ（IL-1F9）3种亚型，拥有共同的受体IL-36R。IL-36可通过激活NF-κB和丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）途径产生大量的细胞因子、趋化因子、黏附分子、蛋白酶等炎症介质，同时这些调控机体免疫系统的细胞因子也能够发挥抗肿瘤作用［3］。IL-36能激活体内固有和获得性免疫反应，并在调节免疫耐受和自身免疫炎症之间的平衡中发挥关键作用。IL-36也能上调树突状细胞表面的CD80、CD86和MHCⅡ，并诱导树突状细胞分泌 IL-12、IL-1、IL-6、TNF-α和 IL-23。此外，IL-36还能够促进细胞分泌免疫炎症因子IFN-γ等，使浸润肿瘤的T细胞或引流淋巴结中的T细胞分化成具有效应功能的T细胞，从而发挥抗原特异性T细胞抗肿瘤的效应［4-5］。因此，IL-36亚家族成员可有效恢复、激活肿瘤中浸润淋巴细胞的活性，从而有助于抑制肿瘤的进展。

本研究通过制备稳定表达IL-36γ的小鼠黑色素瘤B16细胞株和构建小鼠B16荷瘤模型，阐明了分泌表达于肿瘤中的IL-36γ能显著抑制B16肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存期。但这种抑制肿瘤生长的效果是暂时的，后期肿瘤仍然迅速生长，这可能与后期IL-36γ激活、诱导的效应性T细胞因免疫卡控点分子PD-1、TIM-3等上调而导致功能耗竭有关，也可能同时与免疫抑制性细胞群体如调节性T细胞、髓源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）数量增加而密切相关，其中的详细机制尚待进一步研究。因此，在此基础上，寻求合适的手段与IL-36γ进行联合运用，进一步促进或维持IL-36γ激活的T细胞功能、消除或降低调节性T细胞与MDSCs的抑制作用，对探讨、开辟肿瘤治疗新途径和新方法具有重要的理论指导意义。

紫杉醇具有抑制肿瘤细胞有丝分裂和阻碍纺锤体形成的作用［6-7］。此外，紫杉醇尚具有免疫调节功能。相关文献报道，低剂量紫杉醇对肿瘤微环境中的T细胞、自然杀伤性细胞、树突状细胞等均具有调控作用［8］。因此，在采用IL-36γ进行肿瘤免疫治疗时，给予合适剂量的紫杉醇可能有助于提高IL-36γ抗肿瘤免疫应答作用。但由于化疗药物，特别是在剂量较大的情况下，对机体的抗肿瘤免疫应答具有抑制作用，所以有必要摸索合适的紫杉醇给药剂量，以保证既能在一定程度上发挥其直接的抑肿瘤作用，又能协同促进IL-36γ抗肿瘤免疫应答。

因此，我们进一步探讨了不同剂量紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤作用的影响。结果显示，在实验采用的剂量范围内，紫杉醇对无IL-36γ过表达的B16肿瘤生长未产生显著影响。这可能与所采用紫杉醇剂量尚不足以抑制B16生长有关。值得注意的是，较低剂量紫杉醇则对IL-36γ介导的抗肿瘤作用产生了一定的协同效应，这可能与低剂量紫杉醇在一定程度上促进了肿瘤微环境中的T细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的功能有关，也可能与紫杉醇介导了对MDSCs的抑制作用有关，具体作用机制有待进一步研究［9］。然而，较高剂量的紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤作用产生了抑制作用，这可能与化疗药物在大剂量存在的情况下，对机体的抗肿瘤免疫应答也同时具有抑制和破坏性作用有关［10］。对肿瘤中IFN-γmRNA表达水平的检测结果也进一步证实了较高剂量紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤免疫功能具有抑制作用，而低剂量紫杉醇则对其介导的肿瘤免疫应答具有促进作用。

综上，本研究初步揭示了不同剂量紫杉醇对IL-36γ介导的抗肿瘤作用会产生抑制或协同促进两个相反的影响，这为采用IL-36γ联合化疗药物治疗肿瘤，从策略和方法上提供了理论基础。