B7共刺激分子在恶性血液病细胞株中的表达特征

张巍，林江，陈巧云，钱震，克晓燕，钱军

（1.江苏大学附属人民医院血液内科，江苏镇江212002；2.江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江212002；3.北京大学第三医院血液内科，北京100191）

T细胞活化需要双信号系统：第一信号为“抗原肽—主要组织相容性复合体—T细胞抗原受体”构成的抗原特异性识别信号；第二信号为协同刺激信号，主要由抗原递呈细胞表面的B7共刺激分子和CD28分子介导。目前已发现十余个B7家族成员，在淋巴和非淋巴器官均有表达，与相应受体结合通过调节T细胞从而参与抗肿瘤免疫；一些负性共刺激分子在人类多种肿瘤组织中异常表达，与肿瘤的生物学特性及患者预后密切相关，还可通过非免疫调控作用直接参与肿瘤形成［1-2］。多种肿瘤细胞通过下调胞膜HLA-Ⅰ类分子表达，减弱CD8+T细胞识别肿瘤的能力；通过下调胞膜HLA-Ⅱ类分子表达，削弱CD4+T细胞吞噬肿瘤细胞或内化抗原肽的能力，实现免疫逃逸［3］。然而，B7家族分子、HLA抗原在恶性血液病中的表达特征及意义尚未完全阐明，不同类型血液肿瘤中具体何种B7分子可作为其分子靶标尚不清楚。因此，本研究选取13种人类恶性血液病细胞株并以12例健康志愿者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）作为对照，采用流式细胞术检测 B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子，B7-H1、CD279、B7-H3和 B7-H4膜蛋白表达以及B7-H1、B7-H3和B7-H4等胞质和（或）胞核蛋白表达，为进一步研究B7分子在恶性血液病中的作用及靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

澳洲胎牛血清（美国 HyClone公司）；RPMI-1640培养基、IMDM（美国Gibco公司）；PE标记抗人B7.1单克隆抗体（克隆 L307.4）、FITC标记抗人B7.2单克隆抗体［克隆2331（FUN-1）］、FITC标记抗人HLA-Ⅰ单克隆抗体（克隆G46-2.6）、APC标记抗人HLA-Ⅱ单克隆抗体（克隆G46-6）、PE标记抗人B7-H1单克隆抗体（克隆MIH1）和相应同型对照抗体（美国BD公司）；APC标记抗人CD279单克隆抗体（克隆J105）、APC标记抗人B7-H3单克隆抗体（克隆7-517）、PE标记抗人B7-H4单克隆抗体（克隆H74）和相应同型对照抗体（美国eBioscience公司）。固定破膜试剂盒BD IntraSureTM试剂盒（美国BD公司），固定破膜试剂盒Foxp3／转录因子染色缓冲液试剂盒（美国eBioscience公司）。

1.2 细胞株及细胞培养

人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞株、人急性单核细胞白血病U937细胞株、人慢性髓系白血病K562细胞株、人Burkitt淋巴瘤Raji和CA46细胞株、Maver和Z138（人套细胞淋巴瘤细胞株）、Jurkat、JurkatE6-1和 Molt-4（人 T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤细胞株）、Hut-78（人皮肤T细胞淋巴瘤细胞株）和YTS（人NK／T细胞淋巴瘤细胞株）购自美国模式培养物保藏所（ATCC）。人多发性骨髓瘤CZ1细胞株由上海长征医院惠赠。

HL-60、U937、K562、Raji、Z138、Jurkat、Jurkat E6-1、Molt-4、和CZ1细胞株分别于RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL及链霉素100μg／mL）中培养。CA46、Hut-78和 YTS细胞株分别于RPMI-1640培养基（含20%胎牛血清、青霉素100 U／mL及链霉素100μg／mL）中培养。Maver培养于IMDM中（含10%胎牛血清、青霉素100 U／mL及链霉素100μg／mL）。上述细胞株均在37℃，5%CO2恒温培养箱中常规培养，2～3 d换液及传代，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 健康体检者血样的采集与处理

本研究分别经江苏大学附属人民医院和北京大学第三医院伦理委员会审批通过。签订知情同意书后，分别抽取12例健康志愿者空腹肘前静脉血进行检测。志愿者中男女各6例，年龄19～40岁，均无血液、心、肝、肾、消化、神经精神系统疾病和代谢异常等病史，无近期手术史，采血前1个月内及采血期间未服用任何药物，采血期间禁烟、酒及含咖啡因饮料，于北京大学第三医院体检中心进行常规健康体检均合格。

血样的处理：采集上述志愿者肝素抗凝外周血4 mL，加入4 mL PBS混匀，将稀释后血液缓慢加至8 mL人淋巴细胞分离液面上，400×g离心20 min，吸取单个核细胞层，PBS洗涤后重悬备用。

1.4 流式细胞术检测B7共刺激分子的表达及亚细胞定位

1.4.1 B7分子和HLA抗原膜蛋白水平检测 分别取12例健康志愿者PBMCs和13株人类恶性血液病细胞，用预冷PBS洗涤2次后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×106／mL。分别加入20μL B7.1、20μL B7.2、20μLHLA-Ⅰ、20μLHLA-Ⅱ、20 μL B7-H1、5μL CD279、5μL B7-H3和5μL B7-H4的单克隆抗体以及相应同型对照抗体，室温避光孵育30 min。鞘液洗涤2次后，流式细胞仪检测，计算表达率和相对表达，相对表达以平均荧光强度（MFI）计算，阳性表达分：“++”，即lg目的分子MFI值／lg同型对照MFI值≥2；“+”，即lg目的分子MFI值／lg同型对照MFI值＜2。实验至少重复3次。

1.4.2 3种负性B7分子胞质蛋白水平检测 应用BD公司固定破膜试剂盒，将上述单细胞悬液分别加入100μL破膜剂A液，室温避光孵育5min；鞘液洗涤1次后，加入50μL破膜剂B液，再分别加入20μL B7-H1、5μL B7-H3和5μL B7-H4的单克隆抗体以及相应同型对照抗体，室温避光孵育30 min。鞘液洗涤2次后，流式细胞仪检测，计算表达率。实验至少重复3次。

1.4.3 3种负性B7分子胞核及胞质蛋白水平检测应用eBioscience公司固定破膜试剂盒，将上述单细胞悬液分别加入1 mL破膜剂工作液（固定／破膜浓缩液与固定／破膜稀释液以1∶3比例混合），室温避光孵育30 min；再加入1 mL破膜缓冲液工作液（10×破膜缓冲液以1∶10比例稀释），室温避光孵育20 min。离心后鞘液重悬细胞，分别加入20μL B7-H1、5μL B7-H3和5μL B7-H4的单克隆抗体以及相应同型对照抗体，室温避光孵育30 min。鞘液洗涤2次后，流式细胞仪检测，计算表达率。实验至少重复3次。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件，实验数据用均数±标准差（±s）表示，两组均数比较采用两独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两相互比较用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人类恶性血液病细胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表达

结果显示（图1、表1），12例健康受试者 PBMCs中，中性粒细胞（PBN）、单核细胞（PB Mo）、淋巴细胞（PB L）均不表达B7.1；大部分单核细胞和小比例PB N表达B7.2，相对表达偏低；除PBN不表达HLA-Ⅱ类分子外，PBMCs均表达HLA抗原，其中HLA-Ⅰ类分子的相对表达明显较高。人类恶性血液病细胞株中，B7.1在急性髓系白血病（HL-60和U937）和T细胞白血病／淋巴瘤细胞中不表达或低表达，在 B细胞淋巴瘤 （Raji、CA46、Maver和Z138）、CZ1和 K562中表达丰度较高；B7.2除在髓系白血病（U937和K562）中低表达、T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤中不表达外，其余细胞中均表达或高表达；HLA抗原在多数细胞中表达率和相对表达均较高，以HLA-Ⅰ类分子最显著（仅K562不表达）；HLA-Ⅱ类分子在U937和HL-60中近半数表达而相对表达偏低，在K562以及T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤细胞中不表达，其余细胞均高表达。

图1 人类恶性血液病细胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表达

对同一肿瘤来源的细胞株而言，4种分子膜蛋白在3株T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤细胞中、HLA抗原在4株B细胞淋巴瘤细胞中表达均一致。而B7.1和B7.2在B细胞淋巴瘤细胞株中存在差异：在Burkitt淋巴瘤来源的Raji中，两种分子表达均较CA46明显升高（t＝22.163，P＝0.000和 t＝3.055，0.038）；套细胞淋巴瘤来源的Maver和Z138相比，B7.1在 Maver中表达较高（t＝5.978，P＝0.004），B7.2则在 Z138中表达较高（t＝-29.968，P＝0.000）。

2.2 人类恶性血液病细胞株中B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白的表达

结果显示（图2、表2），12例健康受试者中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞均不表达B7-H1及其受体CD279、B7-H3和B7-H4。4种分子的膜蛋白仅在少数恶性血液病细胞株中表达：B7-H1仅在Hut-78和Maver中有极低水平表达，其余细胞均不表达。CD279在YTS、套细胞淋巴瘤中表达率和相对表达均较高，在CZ1和Hut-78中分别检测到高和低表达、但相对表达偏低，其余细胞则不表达。B7-H3的表达率在U937中最高，Maver和Z138中较高，K562和Hut-78中较低；相对表达则在U937和Maver中明显较高、在Z138、K562和Hut-78中偏低，其余细胞则不表达。B7-H4仅在HL-60细胞中检测到低水平表达，其余细胞均不表达。

表1 人类恶性血液病细胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表达±s，%

表1 人类恶性血液病细胞株中B7.1、B7.2和HLA抗原膜蛋白的表达±s，%

B7.1 B7.2 HLA-ⅠHLA-Ⅱ表达率 相对表达 表达率 相对表达 表达率 相对表达 表达率 相对表达中性粒细胞 0.17±0.13 - 11.06±1.68 + 99.96±0.04 ++ 0.62±0细胞株.11 -单核细胞 0.30±0.05 - 88.47±1.42 + 99.87±0.06 ++ 97.07±0.25 ++淋巴细胞 1.07±0.12 - 0.56±0.04 - 99.94±0.06 ++ 46.76±1.50 +HL-60 0.16±0.22 - 82.97±2.13 ++ 99.85±0.13 ++ 43.90±2.22 +U937 0.16±0.15 - 12.32±2.35 + 99.90±0.01 ++ 55.83±5.15 +K562 28.79±2.22 + 11.22±0.30 + 0.62±0.06 - 0.70±0.03 -Raji 88.42±2.73 ++ 88.81±1.37 ++ 96.14±1.31 ++ 99.62±0.36 ++CA46 27.07±3.94 + 68.94±11.19 ++ 100.00±0.00 ++ 99.95±0.04 ++Maver 78.94±8.69 ++ 22.46±3.09 + 99.92±0.06 ++ 97.57±2.17 ++Z138 41.48±6.48 + 80.15±1.26 + 99.99±0.00 ++ 93.84±5.35 ++Jurkat 0.89±1.74 - 3.82±1.90 - 99.57±0.08 ++ 1.11±0.40 -JurkatE6-1 0.67±0.94 - 6.07±3.05 - 99.77±0.23 ++ 1.72±2.37 -Molt-4 0.13±0.05 - 1.98±1.95 - 99.32±0.29 ++ 0.46±0.28 -Hut-78 10.82±4.41 + 87.25±4.18 + 97.66±2.33 ++ 99.39±0.60 ++YTS 1.03±0.38 - 25.70±2.89 + 99.55±0.15 ++ 99.89±0.07 ++CZ1 46.41±4.59 + 96.18±0.59 ++ 74.70±4.47 + 99.76±0.09 ++

图2 人类恶性血液病细胞株中B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白的表达

表2 人类恶性血液病细胞株中负性B7相关分子膜蛋白的表达±s，%

表2 人类恶性血液病细胞株中负性B7相关分子膜蛋白的表达±s，%

B7-H1 CD279 B7-H3 B7-H4表达率 相对表达 表达率 相对表达 表达率 相对表达 表达率 相对表达中性粒细胞 1.62±0.25 - 2.83±1.74 - 0.46±0.20 - 1.01±0.84细胞株-单核细胞 0.91±0.13 - 3.93±1.25 - 0.64±0.55 - 1.69±0.72 -淋巴细胞 0.44±0.09 - 5.44±2.52 - 0.23±0.11 - 0.25±0.39 -HL-60 0.19±0.27 - 0.90±0.81 - 0.28±0.30 - 11.92±2.52 +U937 0.23±0.23 - 4.35±2.04 - 95.08±4.12 ++ 2.30±1.26 -K562 0.39±0.02 - 4.96±0.22 - 12.58±2.47 + 2.04±0.31 -Raji 0.36±0.17 - 0.09±0.05 - 1.32±0.47 - 0.70±0.32 -CA46 0.21±0.19 - 1.23±1.22 - 0.12±0.16 - 3.47±1.15 -Maver 6.15±1.29 + 95.89±2.76 ++ 87.46±8.99 ++ 2.02±1.02 -Z138 0.48±0.15 - 90.19±3.76 ++ 80.47±6.12 + 2.38±0.85 -Jurkat 0.33±0.50 - 1.15±0.53 - 0.19±0.16 - 1.23±0.26 -JurkatE6-1 4.16±1.57 - 4.67±2.59 - 1.25±1.73 - 1.74±1.43 -Molt-4 4.73±1.03 - 5.21±2.74 - 0.05±0.04 - 1.42±0.66 -Hut-78 6.81±1.51 + 12.19±6.09 + 10.50±2.82 + 1.18±1.25 -YTS 1.22±0.36 - 98.19±0.13 ++ 1.85±0.82 - 1.67±0.43 -CZ1 0.48±0.27 - 77.25±1.98 + 0.00±0.00 - 0.63±0.42-

2.3 人类恶性血液病细胞株中B7-H1、B7-H3和B7-H4胞质和（或）胞核蛋白的表达

结果显示（图3），12例健康受试者中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞均不表达3种分子。应用BD公司固定破膜试剂盒检测胞质蛋白，结果显示仅在U937、Z138和Maver细胞中有低水平 B7-H3表达，其余细胞均不表达3种分子的胞质蛋白。应用eBioscience公司固定破膜试剂盒检测胞核及胞质蛋白，发现B7-H1在细胞株中均有偏低比例表达，其中 U937、Molt-4和 CA46的表达丰度较高。B7-H3除在CZ1中不表达外，其余12株细胞中均可检测出偏低比例表达，其中Z138和Maver的表达丰度较高。B7-H4在除CZ1外的12株细胞中异常高表达或表达，其中 Raji和 HL-60表达丰度最高，Molt-4、Hut-78、Jurkat和 JurkatE6-1表达居中。

图3 人类恶性血液病细胞株中B7-H1、B7-H3和B7-H4胞质和（或）胞核蛋白的表达

同一肿瘤来源的细胞株中，3种负性B7分子的胞核及胞质蛋白表达亦存在差异：Burkitt淋巴瘤来源的Raji和CA46相比，B7-H1在CA46中表达较高（t＝-5.685，P＝0.005），B7-H3表达无明显差别（t＝1.761，P＞0.05），B7-H4则在 Raji中表达较高（t＝11.655，P＝0.000）。套细胞淋巴瘤来源的Maver和Z138相比，B7-H1在Z138中表达较高（t＝-3.249，P＝0.031），而 B7-H3和 B7-H4表达未见明显差异（t＝-2.710，1.736，P均 ＞0.05）。T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤来源的Molt-4中，B7-H1表达较 Jurkat和 JurkatE6-1升高（q＝9.476，12.154，P均＜0.05），而 B7-H3和 B7-H4表达在3种细胞中无明显差别（F＝3.199，3.653，P均 ＞0.05）。

3 讨论

B7家族共刺激分子在包括血液病在内的多种恶性肿瘤中异常表达，通过介导共刺激或共抑制信号，参与抗肿瘤免疫［2］。HLA抗原在多数肿瘤细胞中低表达或不表达，致肿瘤抗原提呈能力缺陷，影响T细胞活化，参与免疫逃逸［3-4］。不同亚细胞定位的负性B7分子B7-H1、B7-H3和B7-H4与多种肿瘤恶性程度及患者预后相关，可通过非免疫调控作用直接参与肿瘤形成［5-7］，是新的治疗靶点。

本实验结果显示，B7.1膜蛋白主要表达于B细胞淋巴瘤、骨髓瘤细胞中；B7.2膜蛋白除在T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤细胞中不表达外，其余细胞均表达或高表达。这与课题组既往研究结果一致［8］，提示多数人类恶性血液病细胞中，B7.1表达缺失或下调可能参与T细胞抗肿瘤免疫耐受。与多种实体肿瘤不同，接受标准化学免疫治疗的弥漫大B细胞淋巴瘤患者中，HLA-Ⅰ类分子缺乏不是独立预后因素，HLA-Ⅱ类分子缺乏才与无进展生存较短相关［9］。本实验发现HLA-Ⅰ类分子膜蛋白仅在K562中不表达，其余细胞均高表达；HLA-Ⅱ类分子膜蛋白除在K562及T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤细胞中不表达外，其余细胞亦均表达或高表达。这可能与所选细胞株种类有关，另外也提示作为T细胞活化第一信号的重要组分HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子在多数人类恶性血液病细胞中表达基本正常，可能不是相应血液肿瘤发生的主要原因。近期一项研究发现，HLA-Ⅱ类分子膜蛋白表达阳性的B细胞淋巴瘤中，HLA-DM的丢失会引起胞膜不变链肽段异常表达，进而阻止抗原肽的有效呈递［10］，此已成为一种新的肿瘤免疫逃逸机制。因此，T细胞活化第一信号的不同组分在血液肿瘤中的表达及意义需作更深入的研究。

既往研究结果显示，B7-H1膜蛋白广泛表达于间变大细胞淋巴瘤细胞株中，而极少表达于B细胞淋巴瘤细胞株中［11］；B7-H3膜蛋白在 27% （30／111）的急性髓细胞白血病患者肿瘤细胞中表达，其中以M5和M3型最显著［12］；B7-H4膜蛋白在5株非霍奇金淋巴瘤细胞株中表达极少或不表达［13］。本实验结果显示，B7-H1、CD279、B7-H3和B7-H4膜蛋白在恶性血液病细胞中普遍低表达或不表达，仅CD279在 YTS、Maver、Z138和 CZ1中表达丰度较高，B7-H3在U937、Maver和Z138中表达丰度较高；与上述研究基本一致，提示上述B7分子在不同类型血液肿瘤中的作用可能不同，而具体何种分子可作为分子靶标仍需进行后续研究。

为进一步了解3种负性分子B7-H1、B7-H3和B7-H4在恶性血液病细胞中的具体亚细胞定位，本实验分别加用两种破膜剂，结果显示，3种分子的胞质蛋白基本不表达，而胞核及胞质蛋白则在除CZ1外的细胞株中异常表达或高表达，因此这3种分子主要定位于恶性血液病细胞核，与课题组既往研究结果一致［14］，进一步提示3种分子的胞核异常分布可能是参与血液肿瘤进展的重要因素；后续拟加用共聚焦显微成像术、免疫组化等多种检测方法深入研究。3种分子亚细胞定位不同，其临床意义也不同：接受治疗的转移性结直肠癌和前列腺癌患者的循环肿瘤细胞中，B7-H1表达于胞膜和（或）胞质及胞核，仅胞核表达与患者预后较差相关［5］。部分结直肠癌患者中，B7-H3表达于肿瘤细胞核，且丰度与患者预后负相关［15］；而另一部分患者中，B7-H3主要表达于肿瘤细胞的胞质或胞膜及基质中，胞核表达与患者预后无关而与TNMⅠ期患者无复发生存率降低相关［6］。与早期肺腺癌患者相比，B7-H4在转移性胸膜腺癌患者的核膜中表达较高、胞质中表达较低，核膜蛋白水平与Ki-67正相关，提示患者预后较差［7］。针对恶性血液病中3种分子的表达分布如何，特别是胞核表达是否参与肿瘤形成并与患者预后相关，还需后续进行研究。

不同类型的恶性血液病细胞中，B7分子和HLA抗原的膜蛋白表达存在明显差异：急慢性髓系白血病细胞株存在 B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子不表达或不同程度的低表达，B7-H1及CD279不表达，却不同程度表达B7-H4和B7-H3。B细胞淋巴瘤细胞株中，B7.1、B7.2、HLA-Ⅰ类和Ⅱ类分子均表达或高表达，B7-H1和 B7-H4基本不表达，CD279和B7-H3在套细胞淋巴瘤细胞中高表达、而在Burkitt淋巴瘤细胞中不表达。T淋巴母细胞白血病／淋巴瘤细胞株仅高表达HLA-Ⅰ类分子，不表达其余分子。这提示不同类型血液肿瘤的发生发展可能受不同B7和HLA相关分子影响，具体各分子参与的权重有待进一步研究。即使同一肿瘤来源的细胞株，B7分子表达也存在差别，B细胞淋巴瘤细胞差异最显著：Burkitt淋巴瘤来源的Raji和CA46相比，胞膜B7.1、胞膜 B7.2、胞核及胞质 B7-H4在 Raji中较高，胞核及胞质B7-H1在CA46中较高。套细胞淋巴瘤来源的Maver和Z138相比，胞膜B7.1在Maver中较高，胞膜B7.2、胞核及胞质B7-H1在Z138中较高。同种类型恶性血液病中，B7分子的不同表达水平是否影响肿瘤进展及患者预后，有待进一步研究。

综上，本实验提示参与免疫逃逸的主要因素可能是B7.1分子表达缺失或低下，而不是HLA抗原缺乏；负性B7分子的异常表达及分布可能影响血液肿瘤进展；不同类型及同一肿瘤来源细胞中B7分子表达均存在差异，可能涉及肿瘤发生的相关机制。