阿尔茨海默病患者血清及尿液中外泌体的提取鉴定

周颖，王周凡，朱焰，王爱民，陈娟，洪辉，陆微微

(1南华大学附属长沙医院/长沙市第一医院，长沙410005；2湘潭市中心医院)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一种以进行性记忆力减退、认知功能障碍及人格改变为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。外泌体是一种由体内多种类型细胞主动分泌的大小均一、直径30～150 nm的脂质双分子层结构囊泡，含有丰富的蛋白质、脂类以及RNA，可在大多数体液中检测到[1]。外泌体是一种细胞间信息传递媒介，可运载的生物活性分子种类繁多，涵盖了蛋白质、mRNA、microRNA、细胞因子、转录因子受体等多种生物活性物质，参与细胞的生理及病理过程。本研究采用ExoQuick试剂盒提取AD患者血清和尿液中的外泌体，并通过电镜观察及外泌体表面标志物CD63的检测进行鉴定，试图从AD患者血清和尿液中提取外泌体，为外泌体蛋白质组学的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 低温高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，透射电镜(日本HITACHI公司)，电泳仪电源、垂直电泳槽、电转仪(北京六一仪器厂)，ExoQuick-TC、ExoQuick Exosome Precipitation Solution(美国SBI公司)，兔抗CD63(53 kD)、HRP标记羊抗兔二抗(美国SBI公司)，兔多抗GAPDH(杭州贤至生物有限公司)，BSA：牛血清蛋白(碧云天公司)，ECL底物液(美国Thermo公司)，X线胶片(日本柯达公司)，显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)。

1.2 血清及尿液收集 南华大学附属长沙医院2017年1～6月收治散发型AD患者20例，在满足纳入/排除标准[2]并签署知情同意书、经医院伦理委员会批准后成为本项研究的研究对象，随机抽取6例AD患者纳入血清及尿液外泌体提取对象。取其中3例AD患者空腹(至少禁食12 h)外周静脉血5～10 mL，置血清分离胶试管中,室温静置30 min后,4 ℃、3 000 g离心5 min,取上层淡黄色血清,于冰上分装于1.5 mL的EP管后置于-80 ℃冰箱备用。取另3例AD患者的中段晨尿15 mL，置20 mL试管中，并在2 h内置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3 血清及尿液外泌体的提取 ①血清外泌体的提取：将血清标本3 000 g离心5 min,收集上清，去除细胞和细胞碎片。将上清转移到新管里，加入适量的ExoQuick(250 μL血清加入63 μL的ExoQuick)，混匀，4 ℃孵育30 min，将混合物1 500 g离心30 min；弃掉上清，1 500 g离心5 min，小心去除上清，得到的底部沉淀即为外泌体；加入100～500 μL的PBS重悬沉淀，得到外泌体溶液。②尿液外泌体的提取：将尿液标本3 000 g离心5 min，收集上清，去除细胞和细胞碎片。将上清转移到新管里，加入适量的ExoQuick-TC(5 mL尿液加入1mL的ExoQuick-TC)，混匀，4 ℃孵育过夜(时间不少于12 h)，将混合物1 500 g离心30 min；弃掉上清，1 500 g离心5 min，小心去除上清，得到的底部沉淀即为外泌体；加入100 μL的PBS重悬沉淀，得到外泌体溶液。

1.4 血清及尿液外泌体蛋白定量检测 将上述提取的外泌体样品进行适当稀释(样品各取2 μL，分别与18 μL的PBS 混合)。将BSA标准品进行稀释，制成浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2 μg/μL的标准蛋白，分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，标准品孔内加入标准品BSA溶液20 μL，待测孔加入待测外泌体溶液20 μL。加入PBS的2个平行孔为空白对照。按50∶1的比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔200 μL。将外泌体蛋白及BCA试剂盒中A、B混合液于37 ℃避光孵育30 min。用DG-3022A酶标仪测定所有孔的OD568值。根据标准蛋白浓度和待测样品的OD568值作标准曲线图并得出回归方程，根据外泌体蛋白的OD568值，利用回归方程计算出血清及尿液中外泌体蛋白浓度。

1.5 外泌体的鉴定 ①外泌体形态的透射电镜观察：将上述提取的外泌体用2.5%的戊二醛及磷酸缓冲液(戊二醛用PBS稀释成2.5%,pH 7.4)4 ℃固定4 h。再用磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min，1%锇酸及磷酸缓冲液室温固定2 h，再漂洗3次，每次15 min。然后先后用60%、70%、80%、90%、95%、100%、100%的酒精脱水，每次15 min。渗透：按1∶1的体积比例将丙酮与812包埋剂制成混合液对外泌体进行渗透过夜，然后纯812包埋剂渗透过夜。包埋：将渗透的外泌体60 ℃聚合48 h。切片：将包埋的外泌体60～80 nm超薄切片。染色：将外泌体切片铀铅双染色(2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15 min)，室温干燥过夜后电镜观察。②外泌体特异性分子标志蛋白CD63的检测：采用Western blotting法。将外泌体蛋白样品和Marker(外购的商业化产品)加入上样孔，用10%的SDS-PAGE胶电泳分离，转印至PVDF 膜上，用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h，分别加外泌体标准抗体CD63(1∶1 000稀释)及抗体GAPDH(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。洗去多余一抗，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗，将PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h。洗去多余二抗，ELC法显影曝光，用BandScan分析胶片灰度值。

2 结果

2.1 血清及尿液样本中外泌体总蛋白浓度 根据标准蛋白浓度和待测样品的OD568值所作标准曲线图后得到回归方程Y=0.511 5X+0.038 2 ，R2=0.999 3，以此计算得出3例AD患者的血清样本中外泌体蛋白浓度分别为5.206、3.955、4.268 mg/mL，3例AD患者的尿液样本中外泌体蛋白浓度分别为1.811、1.348、1.133 mg/mL。

2.2 外泌体形态 从AD患者血清及尿液中提取到的外泌体大小较均一，呈较典型的圆形或者椭圆形单层囊泡结构，直径30～150 nm，有完整脂质包膜，见图1。

注：图A为血清中外泌体，直径30～50 nm,背景欠清晰；图B为尿液中外泌体，直径50～150 nm，背景较清晰。

图1AD患者血清及尿液中提取的外泌体在透射电镜下的形态

2.3 外泌体特异性分子标志物CD63检测结果 AD患者血清及尿液中外泌体均表达CD63，见图2。3例AD患者血清中外泌体CD63灰度值分别为22 171 837、32 043 050、40 688 491，3例AD患者尿液中外泌体CD63灰度值分别为40 389 779、30 241 742、49 143 331。

注：所提取外泌体蛋白均表达CD63。U代表尿液，Marker为标记，B代表血清。

图23例AD患者血清外泌体蛋白及3例AD患者尿液外泌体蛋白的CD63免疫印迹条带

3 讨论

目前所使用的 AD 诊断标准都是以临床表现为基础，结合病史、精神状态、认知和心理学检查结果，并除外其他可能导致痴呆的疾病[3]。但事实上AD的病理改变在 AD 临床症状出现之前已经发生了多年。2011年[2]发表的AD标准(NIA-AA)纳入了生物标志物，即功能影像学显示特殊脑区皮层葡萄糖代谢率下降或 Aβ42表达降低和(或)tau蛋白表达升高，然而由于受到资源和操作程序等因素的限制，生物标志物不能广泛运用于 AD 的诊断性筛查。

外泌体作为膜性小囊泡，可以由神经元和星形胶质细胞分泌，与受体细胞结合并被内吞入细胞内，然后再与胞内体胞膜融合，调控分选疾病相关蛋白，从而影响疾病进程[4]。研究[5]表明，外泌体在神经发育和再生、皮质和海马神经元突触可塑性方面都发挥重要的作用，而且具有免疫刺激特性，在病理刺激或受损伤情况下活化和传播炎症反应。外泌体越来越多的被证明参与细胞间信号传递，其将一些有功能的蛋白、DNA和RNA传递给其他细胞，以改变接受细胞的生物学活性[6]。有研究[7]证明AD患者的β-淀粉样蛋白中含有大量与外泌体相关的蛋白，且被认为与AD发病相关。2011年Alvarez等[8]首次成功利用外泌体治疗大鼠AD，显著下调了AD相关蛋白的表达(下降了62%)，减少了β-淀粉样蛋白的沉积。外泌体还可以作为AD患者清除体内β-淀粉样蛋白的主要载体[9]。

由于外泌体形态小，易透过血脑屏障[10]，并随液体流动至全身而不易被吞噬细胞吞噬，因此不同来源的外泌体可在血液、脑脊液、尿液等体液中检出。外泌体提取的方法有超高速离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法和试剂盒提取法等[11]，但没有一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度、生物活性。超高速离心法操作耗时长,且得到的外泌体样本纯度不够[12]。密度梯度离心法能够获得高纯度的外泌体，但是由于操作过程繁琐、难度较大，不适用于外泌体的大量提取[13]。近年来，超滤法及聚乙二醇沉淀法等新的方法用于外泌体的分离提纯，也取得了不错的效果。本研究采用免疫沉淀法(ExoQuick 试剂法)成功从AD患者血清和尿液中提取外泌体，血清中提取的外泌体背景较模糊，而尿液中较清晰，考虑血清中混杂干扰因素较多。后续实验将继续寻找差异表达的外泌体蛋白，为AD的诊断和治疗提供理论依据。