宫颈癌组织中卵泡抑素样蛋白1的表达变化及其意义

洛若愚,张红,,胡晓霞,毛林,刘珍,米思倩

(1武汉大学人民医院,武汉430000；2广西壮族自治区人民医院)

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。在我国，每年宫颈癌新发病例约有10 万，约占世界新发病例总数的20%，且近年来有地区性增长及年轻化的趋势[1, 2]。宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)感染关系密切，但有研究[3]证实，单一的HPV感染不足以导致宫颈癌的发生，某些基因和免疫因素也发挥了重要作用。研究[4～9]表明，卵泡抑素样蛋白1(FSTL1)在肿瘤的发生发展过程中作为癌基因或抑癌基因发挥作用[4～7]，然而FSTL1在宫颈癌发生发展中的作用目前未见报道。本研究对宫颈癌组织中的FSTL1 mRNA及蛋白的表达情况进行了观察，并对其表达水平与宫颈癌患者临床病理参数、生存时间的关系进行了分析，探讨其在宫颈癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2012年9月～2017年6月在广西壮族自治区人民医院接受手术治疗(术前未接受辅助治疗)的部分宫颈癌患者(共140例,其中21例既检测FSTL1 mRNA，又检测FSTL1 蛋白)，术中均留取癌组织，有62例同时留取癌旁组织(取材时应距肿瘤边缘尽可能远，至少大于0.5 cm，28例检测FSTL1 mRNA，34例检测FSTL1蛋白)。有77例宫颈癌患者的癌组织用于FSTL1 mRNA的检测，其中年龄≥50岁者39例、<50岁者38例；鳞癌60例，腺癌15例，混合癌1例及子宫内膜样腺癌1例；肿瘤高分化19例，中分化32例，低分化26例；肿瘤最大直径>4 cm者20例、≤4 cm者57例；FIGO分期ⅠB期48例、Ⅱ期20例、≥Ⅲ期9例；肿瘤浸润深度占宫颈壁全层的百分比>50% 者44例、≤50%者33例；有淋巴结转移者19例，无淋巴结转移者58例；有血管浸润者30例，无血管浸润者47例；有神经浸润者7例，无神经浸润者70例；癌灶累及子宫及附件者22例，未累及子宫及附件者55例。有84例宫颈癌患者的癌组织用于FSTL1 蛋白的检测，其中年龄≥50岁者36例、<50岁者48例；鳞癌70例，腺癌14例；肿瘤高分化18例，中分化48例，低分化18例；肿瘤最大直径>4 cm者10例、≤4 cm者74例；FIGO分期ⅠB期61例、Ⅱ期23例；肿瘤浸润深度占宫颈壁全层的百分比>50%者52例、≤50%者32例；有淋巴结转移者15例，无淋巴结转移者69例；有血管浸润者44例，无血管浸润者40例；有神经浸润者7例，无神经浸润者77例；癌灶累及子宫及附件者39例，未累及子宫及附件者45例；术后均接受电话随访。另取正常宫颈组织44例份作对照(22例份用于FSTL1 mRNA检测，22例份用于FSTL1 蛋白检测)，分别来自子宫脱垂患者5例、子宫内膜异位症患者19例、子宫肌瘤患者20例。

1.2 受检组织中FSTL1 mRNA的检测方法 采用实时荧光定量PCR技术。用TRIzol试剂(Invitrogin 公司)按说明书提取受检组织总RNA，经37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s逆转录为cDNA(TAKARA逆转录试剂盒)。以GAPDH基因作为内参。参照SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书，经95 ℃预变性15 min，40个循环(95 ℃ 10 s 、60 ℃ 32 s)进行PCR扩增。用 2-△△Ct表示受检组织中FSTL1 mRNA的相对表达量。FSTL1基因上、下游引物分别为5′-GAGGGCAAGAGTACACCA-3′和5′-TACGGCATAGACGACAGC-3′，GAPDH基因上、下游引物分别为 5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′和5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′；引物由Primer Bank设计，美国Invitrogen公司合成。

1.3 受检组织中FSTL1蛋白的检测 受检组织石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡、水化。采用免疫酶标法(即用型二步法)染色，柠檬酸钠高温高压修复抗原，3%H2O2去内源性过氧化物酶。滴加一抗FSTL1(1∶250,Abcam公司)4 ℃过夜，二抗酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物(福州迈新生物技术开发有限公司)37 ℃孵育20 min，DAB(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，蒸馏水终止，苏木素(北京索莱宝科技有限公司)复染，盐酸酒精分化，氨水反蓝，梯度酒精脱水，中性树胶封片。镜下观察封片，计算每个高倍镜(200×)视野中FSTL1蛋白阳性(胞核和胞质呈现不同程度的浅黄色或褐色，以胞核为主)细胞所占比例，阳性细胞 0～25%计1分、>25%～50%计2分、>50%～75%计3分、>75%～100%计4分；细胞不着色为阴性计0分，弱阳性(浅黄色)计1分，中阳性(棕黄色)计2分，强阳性(棕褐色)计3分[8]；最终免疫反应评分为FSTL1蛋白阳性细胞所占比例与阳性细胞染色强度之和。以宫颈癌组织最终免疫反应评分中位数为界，将84例宫颈癌患者分为癌组织FSTL1蛋白高表达组和低表达组，并分析宫颈癌组织FSTL1蛋白表达量对患者术后生存时间的影响。

2 结果

2.1 宫颈癌组织、宫颈癌旁组织和正常宫颈组织中FSTL1 mRNA和蛋白相对表达量比较 宫颈癌组织、宫颈癌旁组织、正常宫颈组织中FSTL1 mRNA的相对表达量分别为0.36±0.05、2.15±0.40、2.52±0.50，FSTL1蛋白的表达量分别为(3.33±0.24)、(4.76±0.25)、(5.41±0.22)分；宫颈癌组织中的FSTL1 mRNA和蛋白的表达量与宫颈癌旁组织及正常宫颈组织中的表达量相比，P均<0.05；宫颈癌旁组织中FSTL1 mRNA和蛋白的表达量与正常宫颈组织相比，P均>0.05。

2.2 宫颈癌组织中FSTL1 mRNA和蛋白的表达量与宫颈癌患者临床病理参数关系 宫颈癌组织中，FSTL1 mRNA的表达量与肿瘤大小、浸润深度、分化程度以及FIGO分期有关(P均<0.05)， FSTL1蛋白的表达与肿瘤分化程度、肿瘤大小有关(P均<0.05)，FSTL1 mRNA和蛋白的表达与患者年龄、病理类型、淋巴转移、血管浸润等无关(P均>0.05)，见表1。

表1 FSTL1的表达量与宫颈癌患者临床病理参数的关系

注：*为肿瘤浸润深度占宫颈壁全层的百分比。

2.3 宫颈癌组织中FSTL1蛋白表达与宫颈癌患者生存时间的关系 84例接受宫颈癌组织FSTL1蛋白检测的宫颈癌患者中FSTL1蛋白低表达45例、高表达39例。此84例患者术后电话随访2～36个月(中位随访时间为23个月)，其中失访11例、死亡2例、复发3例。宫颈癌组织中FSTL1蛋白高表达和低表达者的总体生存时间(分别为26、20个月)和无瘤生存时间(分别为21、27个月)相比，P均>0.05。

3 讨论

FSTL1蛋白是一种分泌性糖蛋白，除外周淋巴细胞以外，几乎所有的哺乳动物细胞均有FSTL1的表达;FSTL1基因定位于人的3q13.33染色体，由308个氨基酸构成，其相对分子质量约为35 kDa。FSTL1含有1个卵泡抑素样结构域(FS)和1个细胞外钙离子结合区域(EC)，EC结构域其后紧相连的C端存在与血友因子(VWC)同源性的结构域，属于SPARC家族蛋白之一。FSTL1在大多数肿瘤如鼻咽癌[6]、子宫内膜癌[4]、卵巢癌[4]、肺癌[9]中表达下调，Chan等[4]发现FSTL1在子宫内膜癌和卵巢癌细胞和组织中表达下调，FSTL1 mRNA和蛋白在非小细胞肺癌细胞中也表达下调[10]。FSTL1在结肠癌上皮细胞胞质中、癌旁组织中、患者血浆中表达均上调[5]，在食管鳞癌[11]、脑胶质细胞瘤[12]和前列腺癌[13]中表达上调。本研究发现，宫颈癌组织中FSTL1 mRNA及蛋白的相对表达量明显低于宫颈癌旁组织及正常宫颈组织。推测FSTL1可能作为抑癌基因参与宫颈癌的发生发展，后续我们将进一步进行验证。

有研究[4, 5, 7]显示FSTL1的异常表达与患者的临床病理关系密切。Chan等[4]研究发现，FSTL1 mRNA低表达不仅与非内膜样腺癌、低分化、浸润深肌层、侵犯宫颈间质以及淋巴脉管转移的子宫内膜癌患者呈正相关，还与低分化、双侧卵巢肿瘤、包膜完整的卵巢癌患者呈正相关。另有文献[5]报道，FSTL1蛋白表达量与结肠癌患者的肿瘤大小、分级、分期及患者性别没有相关性。然而，Yang等[14]分析肝癌患者组织中FSTL1 mRNA的表达量上调，FSTL1 mRNA的高表达与巨大块肝癌、晚期肝癌、门静脉的侵犯及肝内转移密切相关，并且研究还发现，FSTL1 mRNA的高表达提示患者的术后生存时间相对越短，FSTL1可作为一个术后独立预后指标。本研究结果显示，宫颈癌组织中FSTL1 mRNA的表达与肿瘤大小、浸润深度、分化程度以及FIGO分期有关，FSTL1蛋白的表达与肿瘤分化程度和肿瘤大小有关。这表明FSTL1具有双向调控机制，在不同肿瘤中FSTL1的异常表达与其临床病理参数关系有所不同，发挥着不同的作用。本研究表明FSTL1的低表达与宫颈癌患者的癌组织的浸润深度、分化程度及FIGO分期密切相关，检测FSTL1的表达，有助于我们判断疾病的严重程度，确定最佳的治疗方案及术后预后情况。另外我们还发现宫颈癌组织中FSTL1蛋白高表达者和低表达者的总体生存时间和无瘤生存时间差异无统计学意义，这可能与样本量少、随访时间短有关，后续我们会增加随访时间，进一步探讨FSTL1与患者预后的关系。

总之，本研究发现宫颈癌组织中FSTL1 mRNA 和蛋白均呈低表达，观察癌组织中FSTL1 mRNA和蛋白的表达有助于判断宫颈癌浸润深度、分化程度及FIGO分期，FSTL1可能作为抑癌基因参与宫颈癌的发生发展。