基于氟化硼二吡咯荧光探针的研究进展

舒婷婷，黄文文，杨智慧，喻艳华

（江汉大学 交叉学科研究院，湖北 武汉 430056）

荧光探针作为一种检测工具，主要原理是以荧光光谱为手段，受体与待检测物之间特异结合后（络合或者反应）从而改变荧光基团的结构，导致其荧光光谱发生改变，通过这种前后变化实现对待检测物种的定性或定量分析。这种分析方法由于其灵敏度高、选择性好、操作简单，在环境检测、化学、食品分析、医药等各个方面已经得到广泛应用。用于荧光探针的荧光染料种类繁多，有罗丹明类［1-2］、荧光素类［3-5］、香豆素类［6-7］、萘类［8-9］等，这些荧光染料有的存在荧光量子产率低、光稳定性不好、易光漂白等不足。相对而言，BODIPY类［10-11］荧光染料由于具有非常稳定的光谱性质、较高的荧光量子产率、高摩尔吸光系数、良好的光稳定性、较窄的荧光光谱峰宽、对pH不敏感等优点［10-17］被广泛应用于各类荧光探针。对BODIPY的结构进行修饰，得到的BODIPY衍生物可以作为荧光探针对阳离子、阴离子、小分子、生物分子等进行检测，并可应用于环境检测、食品分析、生命科学、医药诊断等领域［18-23］。

1 BODIPY类染料的基本结构和性质

TIERBS和KREUZER［24］在1968年首次报道BODIPY类荧光染料，其结构式如图1所示。

图1 BODIPY中心骨架结构Fig.1 Structure of BODIPY core

BODIPY基本上是由2分子吡咯与1分子醛类化合物在酸催化下，或者1分子吡咯与1分子酸酐或酰氯化合物缩合后，再与三氟化硼乙醚溶液络合后得到其衍生物［25］。KAROLIN等［26］在1994年报道BODIPY中心骨架结构的性质，其摩尔消光系数在90 000 mol·L-1·cm左右，最大吸收峰在500 nm左右，荧光量子产率大于80%，并且其荧光寿命不受其他极性溶剂的影响，具有稳定的化学性质。但是其衍生物依旧有一些不足，包括水溶性差，发射波长大多都小于600 nm，因此为了扩大应用范围，需要对其进行官能团修饰。目前，通过在改善和修饰BODIPY的结构已经开发出各类基于BODIPY的荧光探针。

2 BODIPY类荧光探针对阳离子的检测

2.1 对Zn2+的检测

锌离子是人体内排在铁离子之后第二丰富的过渡金属离子。Zn2+在人体发育、免疫、内分泌等生理过程中起着极其重要的作用，对神经信号传递、基因表达起调节作用。缺锌易引起免疫功能下降、侏儒症、生殖系统功能受损、缺血症、毒血症、肝硬化等。因此，发展特异性识别Zn2+的探针十分重要。

2018年，XIA等［27］报道了一种对Zn2+有高选择性识别的比率型荧光探针1a（图2）。在V（CH3CN）∶V（0.02 mol∕L HEPES buffer）=1∶1的溶液中探针1a通过与Zn2+1∶1络合，使其最大吸收峰从525 nm红移至552 nm，溶液由浅黄色变为紫色，同时荧光发射光谱的最大吸收峰从540 nm红移至580 nm。此探针能特异性识别Zn2+，且最低检测限可达87 nmol∕L。此外，探针1a可应用到检测活细胞的胞内Zn2+。

图2 Zn2+探针1aFig.2 Zn2+probe 1a

2.2 对Hg2+的检测

Hg2+是一种毒性极强的金属离子，可通过食物链积聚在大脑和肾脏，对中枢神经系统和内分泌系统造成严重损害，会导致一些人类疾病，如肢体疼痛症疾病、水俣病以及Hunter-RusseⅡ综合征。2018年，MAITY等［28］设计合成了基于BODIPY的“off-on”型Hg2+荧光探针2 a（图3），可高选择性、高灵敏度地检测溶液中的Hg2+。该探针BODIPY 8位置上取代基上的氮和氧原子带有孤对电子，在激发光照射下，发生光诱导的电转移（photoinduced electron transfer，PET），导致BODIPY的荧光发生淬灭。当加入Hg2+时，其与氮和氧的上的孤对电子发生配位，从而阻断PET过程，导致荧光显著增强，荧光量子产率由0.048升至0.41，探针荧光强度与Hg2+浓度在0～2.5 nmol∕L范围内成正比，检测限达1.81×10-7mol∕L。该探针与Hg2+是1∶1络合，且络合物的荧光在pH为4.5～8的范围内不受影响，表明其可用于检测活体细胞中的Hg2+，值得注意的是，在探针中加入1倍当量Hg2+后，再加入1倍当量S-会使荧光又恢复到探针原来的情况。这项工作无疑为进一步设计和开发用于环境相关毒性重金属离子检测的BODIPY荧光传感器奠定了基础。

图3 Hg2+探针2aFig.3 Hg2+probe 2a

2.3 对Co2+的检测

Co2+在一些生物过程中发挥着重要的作用，如血液的生成、脂肪的新陈代谢、蛋白质的形成等，但是过量的Co2+会引发一系列的健康问题，比如心脏中毒、哮喘、肺癌等，以及抑制某些酶的活性。因此，无论对环境还是生物体，对钴的痕量检测至关重要。2017年，SENKUYTU等［29］通过“click”反应合成得到一类基于环氧四磷腈的BODIPY类荧光探针3a～3c（图4）。该类探针可在四氢呋喃溶液中选择性的检测Co2+，探针3c的最大激发波长为640 nm，最大发射波长为650 nm。以618 nm激发，其中只有Co2+对探针3c有荧光淬灭效果。同时测定了Co2+在不同浓度下对该探针的梯度效果，并且发现该分子探针与Co2+的络合可能是按4∶1的比例进行络合的。该探针对Co2+的最低检测限达4.27 μmol∕L。

图4 Co2+探针3a～3cFig.4 Co2+probe 3a-3c

2.4 对K+的检测

K+对自然界和人都非常重要。对于已报道的K+探针，存在K+∕Na+选择性差、成本高的缺点，因此发展选择性高，能用于生物体系和自然环境的新型K+探针很有意义。2017年，YAN等［30］报道了冠醚对K+的选择性络合，设计合成了基于聚集导致荧光淬灭（aggregation-caused quenching，ACQ）效应的荧光探针4a（图5）。在DMSO溶液中加入K+后，探针在498 nm处的吸光度逐渐降低，同时510 nm（λex=480 nm）左右荧光发射光谱被一定程度淬灭。探针在溶液V（DMSO）∶V（H2O）=1∶1中的吸光度和荧光强度都比探针在纯DMSO中低许多，表明聚合导致了吸光度下降和荧光淬灭。K+通过与冠醚前体的氧原子络合，缩短两端BODIPY的距离从而导致聚集荧光淬灭。该探针与K+的络合是按1∶1的比例进行，络合常数为 4.3×105（mol∕L）-1。该探针对K+具有很好的选择性。

图5 K+探针4aFig.5 K+probe 4a

2.5 对Ca2+的检测

Ca2+在机体各项生理活动中不可或缺，包括骨骼的生长、凝血过程、神经传导等。2017年，LIU等［31］设计合成了一种基于PET机制的“off-on”型Ca2+探针5a（图6），该探针的BDOIPY的8位连接1，2-二氨基苯氧基乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸（BAPTA），4个强电子供体4-甲氧基苯基的连接使得BODIPY的荧光发生红移，最大发射波长为631 nm，由于氮和氧原子带有孤对电子，当5a遇到激发光照射时，发生PET效应，使得BODIPY的荧光强度减弱，当加入Ca2+后，Ca2+与探针5a络合，阻断PET，导致631 nm处探针荧光增至原来的43倍，体现了探针的高灵敏性，探针在溶液体系为V（MeOH）∶V（MOPS buffer）=1∶1中对Ca2+的检测限为39 μmol∕L。另外，该探针对环境pH有较强的惰性，在pH为5.5～8.5之间检测效果更佳，因此，该探针对于Ca2+检测和生物成像的应用有潜在价值。

图6 Ca2+探针5aFig.6 Ca2+probe 5a

2.6 对Cu2+的检测

铜是所有生物系统中不可缺少的微量元素，在铁和锌之后，排名第三。它广泛分布在血液系统中，作为辅酶因子在许多细胞过程中扮演着关键的角色。但是，当浓度超过细胞所需水平时，会导致铜中毒，引起老年痴呆、肾衰竭以及门克斯和威尔逊疾病等。随着含铜物质在工业和农业中的应用，环境中铜污染已经越来越严重。2014年，ZHANG等［32］报道了一种“off-on”型Cu2+探针6a（图7），此探针可在水介质中对Cu2+进行检测，通过探针与铜离子1∶1鳌合，阻止分子内电荷转移，使得探针荧光增强，在这一过程中，探针在494 nm处吸收峰消失，在499 nm处出现新吸收峰，与此同时，探针的513 nm处的荧光强度急剧增强。探针Cu2+的检测限为2.5×10-8mol∕L，该探针对Cu2+检测，显示出灵敏度高、选择性好、简单、快速、方便的特点，表明该探针可用于真实水样中Cu2+的检测。此外，探针6a可以在Hep G2细胞中对铜离子进行检测，表示该探针对Cu2+的检测具有在生物系统中应用的潜力。

2016年，YANG等［33］报道了一种可视化Cu2+探针7a（图7）。在V（HEPES）∶V（MeCN）=1∶4，pH=7.2溶液中加入Cu2+后，探针与Cu2+是1∶1反应，探针在480 nm处吸收峰红移至570 nm，550 nm处荧光峰红移至600 nm，其他常见金属阳离子对其没有明显干扰，荧光量子产率由0.012增至0.280，探针的检测限达5 μmol∕L。该探针对Cu2+的检测可以应用于BHK细胞的荧光成像研究，说明这对于环境和生理系统方面都有很好的应用前景。

图7 Cu2+探针6a和7aFig.7 Cu2+probe 6a and 7a

2.7 对Au3+的检测

2016年，WANG等［34］报道了一种可用于裸视检测Au3+的荧光探针8a（图8），该探针的BODIPY的6位连接单希夫碱，希夫碱是强的受电子体，当8a受到特定波长的激发光照射时，探针发生分子内的电荷转移（intramolecular charge transfer，ICT），导致BODIPY的荧光淬灭，当加入Au3+后，Au3+通过与希夫碱的氮原子发生络合，促进C==N双键发生水解反应生成含有醛基的BODIPY，从而导致BODIPY的荧光增强。在pH=7.0，V（0.1 M PBS）∶V（EtOH）=7∶3溶液中加入Au3+后，8a吸收峰由536 nm蓝移至497 nm，溶液由紫红色变为浅黄色，此外，荧光量子产率由0.02升至0.72，增长36倍。相比之前报道的探针，该探针对Au3+的检测限可达60 nmol∕L，响应时间更短（90 s），对其他阳离子的抗干扰能力更强；活细胞成像时，表现出更低的细胞毒性，在较高环境温度（25～70℃）中也可以保持自己的化学特性；此化学探针还是第一次成功的在斑马鱼上进行Au3+荧光成像的应用。

图8 Au3+探针8aFig.8 Au3+probe 8a

2016年，WANG等［35］报道了一种反应型Au3+荧光探针9a（图9），该探针BODIPY的8位连接苯乙炔基苯胺，由于存在PET效应，导致该探针的荧光发生淬灭，Au3+的加入，使其苯乙炔基苯胺发生环化反应生成苯基吲哚，有效抑制了PET过程，使得9a的荧光得到增强，量子产率由0.007 8增至0.180 0。该探针对Au3+响应时间小于60 min，并且可用于Au3+活细胞生物荧光成像。

图9 Au3+探针9aFig.9 Au3+probe 9a

3 BODIPY类荧光探针对阴离子的检测

3.1 对CN-的检测

氰化物是剧毒物。2016年，WU等［36］报道了一种亲核加成反应型CN-探针10a（图10），经过机制研究证明，CN-与BODIPY的一个吡咯环发生亲和加成反应，破坏分子的共轭体系导致其吸收光谱和荧光发射光谱发生变化明显。在THF中，加入10倍当量的CN-后，探针10a在650 nm处近红外吸收消失，溶液颜色由深蓝变成浅棕色，680 nm处荧光（λex=590 nm）被完全淬灭。该探针对CN-响应迅速（常温小于5 min）。

图10 CN-探针10aFig.10 CN-probe 10a

2018年，本课题组设计合成了一种基于BODIPY检测CN-的荧光探针11a（图11），BODIPY的8位的醛基与半花菁发生缩合反应得到探针11a，当特定波长的激发光照射时，由于存在ICT效应，导致11a的荧光强度非常弱，当探针11a与CN-发生亲核加成反应后，破坏了ICT效应，导致探针分子的荧光增强，量子产率由0.015增强至0.330。该探针可在水相中检测CN-，最低检测限可达59 nmol∕L，响应时间非常快速（3 s），对CN-的选择性好［37］。

图11 CN-探针11aFig.11 CN-probe 11a

3.2 对F-的检测

F-在环境与生物中至关重要。2015年，FU等［38］报道了一系列的F-探针，其中F-探针12a（图12）对F-有很好的选择性，在V（MeCN）∶V（H2O）=95∶5溶液中，加入50倍当量F-后，F-与探针发生脱保护反应，得到末端为炔基的化合物，使其吸收峰从670 nm蓝移至490 nm，荧光发射峰从687 nm蓝移至570 nm处，荧光增强至原来40倍，检测限达92.7 nmol∕L；对于F-探针12b（图12），探针荧光量子产率为0.44，检测F-时，探针吸收峰从630 nm蓝移至464 nm，荧光发射峰从624 nm蓝移至542 nm，荧光强度增至原来的7倍，检测限达22.9 nmol∕L，在365 nm紫外灯下溶液荧光颜色由红色变成黄色，响应时间小于20 min。

图12 F-探针12a和12bFig.12 F-probe 12a and 12b

3.3 ClO-的检测

2017年，LI等［39］报道了一种反应型ClO-荧光探针13a（图13），该探针BODIPY的6位连接2，4-二硝基苯肼，C==N 键的形成导致BODIPY荧光的淬灭，在pH=7.4，V（0.01 M PBS）∶V（DMF）=1∶1溶液中加入ClO-，使其发生亲核加成反应，促使C==N键水解得到6-醛基BODIPY，从而导致探针13a的吸收峰由543 nm蓝移至505 nm，溶液颜色由粉色变为浅棕色，因此对ClO-的定性检测可直接通过肉眼观察；在515 nm处出现荧光峰，荧光量子产率由0.059增至0.560。该探针对ClO-响应迅速（响应时间小于7 min），且其他阴离子无干扰，该探针可应用于生活用水和活细胞（比如Hep G2细胞）中检测ClO-。

图13 ClO-探针13aFig.13 ClO-probe 13a

3.4 对HSO4-的检测

2016年，WANG等［40］报道了一种“off-on”型HSO4-探针14a（图14），该探针BODIPY的6位连接希夫碱，在特定激发光的照射下，14a由于存在ICT效应，导致荧光强度非常弱，在V（THF）∶V（H2O）=8∶1溶液中，加入HSO4-后，HSO4-由于在水中可电离出氢离子，酸性条件下促进C==N键发生水解反应，生成6-醛基BODIPY，从而导致探针分子14a的吸收峰从523 nm蓝移至497 nm，其A497nm∕A526nm的比值增长150倍，溶液颜色由粉色变为黄色，并且探针从533 nm处几乎没有荧光增强至原来114倍，探针检测HSO4-是探针与其1∶1进行的反应，对HSO4-的检测可以达到6.45×10-8mol∕L。此外，细胞成像实验表明，探针可以应用在Hela细胞中，对HSO4-进行监测。

图14 HSO4-探针14aFig.14 HSO4-probe 14a

4 BODIPY类荧光探针对小分子的检测

BODIPY探针可以用于检测小分子，比如NO、H2O2、硫醇等。以硫醇为例，其分子量低，苯硫酚（PhSH）和脂肪族硫醇在化学化工和生物系统中的地位很重要。对人而言，细胞内硫醇浓度的改变会引起各种疾病，如肝损伤、阿尔兹海默症、心血管疾病等。另一方面，苯硫酚在有机合成中发挥重要作用，广泛应用于制备化学品、药品、工业产品等。然而，苯硫酚及其衍生物有剧毒，长期接触苯硫酚可能严重损害中枢神经等，也可导致呼吸增加、肌肉无力、后肢瘫痪、昏迷、甚至死亡。因此，有选择性地将有毒的苯硫酚从生物学上重要的脂肪族硫醇中区分出来，在生物科学领域有相当大的意义。

2017年，LIU等［41］报道了一种反应型苯硫酚荧光探针15a（图15），该探针为单氯代BODIPY，在BODIPY的3位引入甲酰胺，控制15a的反应活性，使其5位的氯可选择性地与苯硫酚发取代反应，在pH=7.4，V（乙腈）∶V（HEPES buffer）=1∶3溶液中检测PhSH时，518 nm吸收峰红移至558 nm，可通过肉眼观察到溶液由橙色变为粉色，荧光发射峰从540 nm红移至581 nm，其F581nm∕F540nm的比值从0.21增至135.18，增长650倍，检测限达36.9 nmol∕L，在365 nm紫外灯下溶液颜色由绿色变为黄色荧光。探针对PhSH的响应迅速，可以实现在水溶液中对PhSH的检测，该探针还可应用于细胞荧光成像。

图15 PhSH探针15aFig.15 PhSH probe 15a

5 BODIPY类荧光探针在生物检测方面的应用

近年来，荧光标记多肽被广泛应用于蛋白质的检测。2017年，RAMON等［42］报道了一种标记细胞凋亡小体中的磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的荧光Trp-BODIPY环状肽16a（图16），16a与PS具有很强的亲和力，当它与PS络合后，荧光强度明显增强。不同于膜联蛋白，Trp-BODIPY环肽可在不依赖Ca2+时对PS有很强的亲和力，其可适用于很多生理条件下的标记试验。在体外磷脂单分子层试验中，16a可跟踪显示脂质-水分成分的变化。流式细胞实验通过16a从BL2人体淋巴瘤细胞中确认对凋亡小体的标记，这对在多种生物环境下去监测、描述亚细胞结构提供了一个新机会。

图16 Trp-BODIPY环状肽16aFig.16 Trp-BODIPY cyclic peptide 16a

2017年，LI等［43］报道了一类基于BODIPY-三苯胺型检测牛血清白蛋白（BSA）的新型探针17a～17c（图17），它们的光学物理性质见表1。探针17a～17c可以在水含量达到80%的溶液中检测BSA，检测BSA是荧光增敏现象，17c对BSA良好的检测是由于强烈的共价键分子之间的相互作用，其中17a已经成功应用于SK-BR-3细胞成像。

图17 BSA探针17a～17cFig.17 BSA probe 17a-17c

2018年，GONG等［44］报道了GSH（谷胱甘肽）比率型荧光探针18a（图18），GSH是生命系统中重要成分，主要起抗氧化、抗衰老作用。GSH异常下降，会引起小孩智力迟钝、肝损伤、阿尔兹海默症、癌症、糖尿病、心血管疾病等。因此，发展新的检测GSH的方法对评估和诊断疾病很重要。探针18a对GSH的检测是对氯的两步亲核取代反应。第一阶段，在GSH在0～1倍当量时，溶液体系为DMSO∕H2O（PBS buffer，V∕V=1∶9，pH=7.4）进行的，诱导荧光颜色由绿色（λem=530 nm）变为黄色（λem=562 nm）（I562nm∕I530nm，单取代），加入过量GSH引起第二阶段荧光颜色变化，从黄色（λem=562 nm）变为红色（λem=597 nm）（I597nm∕I562nm，双取代），探针GSH的反应灵敏，也成功的应用于指导GSH的细胞成像，对细胞内不同浓度的谷胱甘肽有很好的响应。

表1 探针17a～17c的光学物理性质Tab.1 Photophysical properties of probe 17a-17c

图18 GSH探针18aFig.18 GSH probe 18a

6 结论与展望

综上所述，BODIPY作为一类新型的荧光染料，有着优良的光学性质，并且易于官能化衍生出具有不同功能的荧光探针，可以特异性识别各类阴阳离子，小分子以及蛋白质等，很大程度上满足实际应用的需要。随着研究的深入，BODIPY类染料显示出良好的前景，但是依旧存在一些问题需要进一步对BODIPY进行改进。一方面是在已报道的BODIPY探针中很少有近红外荧光发射波长的探针，而且部分探针的选择性和灵敏度有待提高。比率型荧光探针由于可以消除环境、仪器和操作误差使其性能远远优于荧光淬灭或增强型荧光探针，但是在已报道的荧光探针中，比率型探针相对较少。另一方面，在生物应用中，BODIPY的生物相容性也是一个待解决的问题。因此，发展基于BODIPY的比率型近红外荧光探针和生物环境相容性好的荧光探针是今后的研究热点。