自噬相关蛋白在卡培他滨联合奥沙利铂治疗晚期乳腺癌中的相关机制研究

谭小强 胡小辉

(上海市东方医院吉安医院肿瘤科，吉安343000)

乳腺癌现今已成为社会女性面临的重大公共卫生问题，主要发生在乳腺腺上皮组织，严重威胁女性的健康及生命，虽然其死亡率逐渐下降，但近年来在世界范围内的发病率呈逐年上升趋势[1]。乳腺癌的病因尚不明确，其发生可能与家族性遗传，环境污染或激素不当使用等因素有关[2,3]。乳腺并不是维持机体生命活动的重要器官，因此，女性原位乳腺癌并不致命；但乳腺癌细胞容易脱落，游离的乳腺癌细胞可以随血液或淋巴液播散转移至全身，严重危及女性身心健康和生命。乳腺癌临床常采用手术切除、化疗放射及靶向治疗等方法，但针对晚期原发性乳腺癌的治疗方法仍需进一步探究[4,5]。因此，合理准确地判断肿瘤预后、最大化地提高个体化药物的疗效和降低化疗药物的毒副作用是当前临床研究的重点。卡培他滨和奥沙利铂作为主要的抗肿瘤化疗药物，可诱导促进乳腺癌细胞的凋亡和坏死，在肿瘤的发生和发展过程中起到多种途径的调节作用[6,7]，但卡培他滨和奥沙利铂联合应用是否可以通过调节自噬相关蛋白介导的mTOR信号通路调控诱导乳腺癌细胞凋亡，治疗女性原发性晚期乳腺癌尚未见报道。本研究通过检测乳腺癌患者活检标本中自噬相关蛋白及mTOR信号通路相关蛋白的表达，旨在探讨临床上卡培他滨联合奥沙利铂对女性原发性乳腺癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1研究对象及一般资料 选取本院2015年1月～2017年1月收治的60例女性经病理学确诊的原发性乳腺癌晚期患者。平均发病年龄(49.36±4.29)岁。绝经前29例，绝经后31例；Luminal A型28例，Luminal B型18例，HER2阳性型11例，基底样型3例。晚期乳腺癌诊断标准为：①肿瘤侵犯胸壁并固定；②侵犯皮肤，如皮肤溃疡，卫星结节，皮肤橘皮样水肿；③炎性乳腺癌；④同侧腋窝淋巴结融合成团，并与周围组织粘连，固定；⑤患侧上肢水肿；⑥乳腺癌经手术及放疗，化疗再发；⑦合并有锁骨上淋巴结转移、肝脏、肺脏及骨等远处器官转移。乳腺癌的分子分型依据术中切除的肿瘤组织的免疫组化结果进行分型。本研究经本院伦理委员会同意，患者自愿接受临床检查，并签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1治疗方案 患者采用卡培他滨联合奥沙利铂连续治疗2疗程，方法：奥沙利铂第1天和第8天按体表面积一次135 mg/(m2·d)，连续给药4次为一疗程(塞诺菲民生制药有限公司，批号：030805，国药准字J20050065)；卡培他滨第1～14天1 000 mg/m2口服2次/d，21 d为一疗程(连云港润众制药有限公司，批号：H20123425，国药准字H20123425)。

1.2.2观察指标 依据实体瘤疗效评价标准(RECIST)评定化疗药物的临床疗效。在化疗前后1周内分别测量患者乳房肿块的大小及双腋双锁骨上淋巴结等转移情况，用于评估化疗疗效。分为①完全缓解(Complete remission,CR)：肿瘤持续1个月完全消失；②部分缓解(Partial remission,PR)：肿瘤持续1个月体积缩小≥30%，且无其他病变扩展；③稳定(Stable disease,SD)：肿瘤持续1个月体积增大≤20%，体积缩小≤30%；④进展(Progressive disease,PD)：肿瘤体积增大≥20%。患者应在4周后重新测量肿瘤病灶，仍达CR、PR和SD标准者方可最后评定为CR、PR和SD。其中有效=完全缓解+部分缓解，无效=稳定+进展。

1.2.3免疫组织化学法检测与免疫染色定量 取乳腺癌患者的病理石蜡切片标本，室温封闭40 min(5%血清)，加入单克隆抗体mTOR(#2983，Cell Signaling)和LC3-Ⅱ(#3868，Cell Signaling)，碱性磷酸酶二抗(#8681，Cell Signaling)4℃孵育。PBS清洗后加入SP和DAB恒温显色封片。用10×、40×物镜显微镜进行观察。应用ImagePro Plus对免疫组化结果进行分析，并按阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱评分(Immunohistochemical scores，IHS)。IHS=a×b，a代表阳性细胞百分比：a=0，无阳性细胞；a=1，阳性细胞为1%～10%；a=2，阳性细胞为11%～50%；a=3，阳性细胞为51%～80%，a=4，阳性细胞所占比例达81%以上。b代表阳性细胞染色强弱：b=0，阴性；b=1，弱阳性；b=2，中度阳性；b=3，强阳性。

1.2.4Real-Time PCR检测mTOR、LC3-II、Beclin-1、p62和Atg5 mRNA表达含量 采用Real-time PCR法对mTOR、LC3-II、Beclin-1、p62和Atg5 mRNA表达进行检测。Trizol法提取乳腺癌组织中的总RNA，转录合成cDNA进行Real-time PCR操作。实验采用阈值循环数(Cycle threshold,CT)相对定量法，计算不同基因mRNA的表达含量。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。PCR所用引物序列如下：mTOR上游引物5′-CAGTTGCCCAGTGGACTGAAG-3′、下游引物5′-GCTGGTCATAGAGCCGAGAC-3′;LC3-Ⅱ上游引物5′-CAATCACCCTGAGGGAACA-CAACA-3′、 下游引物5′-ATCTGCCTCCACTGG-TCAATGGA-3′；Beclin-1上游引物5′-TCTCGCCTCCTAGCTTATTATAACC-3′、下游引物5′-GATTCGGCACTTCAGGAGCTT-3′；p62上游引物5′-GACTGCGCCTCCTGCGTCTT-3′、下游引物5′-AGCCCGCGGAGGGTCTACAT-3′；Atg5上游引物5′-CCCTACACGAAGCACCAGACACT-3′、下游引物5′-GCGGGCCCTGGAGATTCATC-3′。

1.2.5Western blot检测蛋白mTOR、LC3-II、Beclin-1、p62和Atg5含量 取乳腺癌组织冰上裂解2 h，并测量蛋白浓度。常规恒流进行电泳和转膜，按稀释比例加入mTOR(#2983，Cell Signaling)、LC3-Ⅱ(#3868，Cell Signaling)、Beclin-1(#4747，Cell Signaling)、p62(# 23214，Cell Signaling)和Atg5(# 9980，Cell Signaling)一抗和二抗(#4418、#4410，Cell Signaling)。用ECL显色剂显色，对各组蛋白泳道条带进行灰度扫描分析，计算得出mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg5蛋白表达量。

1.2.6抗肿瘤免疫功能特征检测 采集患者治疗前后清晨空腹血，使用流式细胞术检测患者血液内T 淋巴细胞亚群及 NK 细胞。CD3+、CD4+、CD8+、CD16+/CD56+分别代表 T细胞、TH细胞、TS细胞和NK 细胞(单克隆抗体和流式细胞仪美国 Becton Dickinson 公司产品)。

2 结果

2.1疗效诊断 经RECIST标准评价卡培他滨联合奥沙利铂化疗疗效的患者疗效情况，其中化疗有效为34例(56.67%)，无效为26例(43.33%)，说明卡培他滨联合奥沙利铂化疗疗效显著，差异具有统计学意义(χ2=10.385，P=0.001)。

2.2肿瘤免疫功能特征检测 与化疗前患者血清中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD16+/CD56+表达量相比，卡培他滨联合奥沙利铂化疗后乳腺癌血清中CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD16+/CD56+表达量显著升高，CD8+含量显著降低，具有明显的统计学差异(P<0.05)。见表2。

表1卡培他滨和奥沙利铂化疗疗效

Tab.1CapecitabineandOxaliplatinChemotherapy

Groupsn(+)(-)χ2PEffective3462810.3850.001Noneffective261511

2.3mTOR和LC3-Ⅱ免疫组织化学结果 图1，乳腺癌患者应用卡培他滨联合奥沙利铂化疗前后mTOR和LC3-Ⅱ蛋白免疫组化染色强度具有明显的差异(P<0.05)。卡培他滨联合奥沙利铂化疗后乳腺癌组织中mTOR显著降低，LC3-Ⅱ显著升高差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4mTOR和LC3-Ⅱ的蛋白表达水平 对mTOR和LC3-Ⅱ蛋白免疫组化结果进行分析，与化疗前乳腺癌组织中的蛋白表达量相比，卡培他滨联合奥沙利铂化疗后乳腺癌组织中mTOR蛋白表达含量显著降低，LC3-Ⅱ蛋白表达含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 免疫组织化学检测结果(×400)Fig.1 Immunohistochemistry results(×400)

IHSmTOR proteinexpressionLC3-Ⅱ proteinexpressionPre-chemotherapy9.783±0.2182.548±0.362Post-chemotherapy3.145±0.1691)7.314±0.4171)

Note：Compared with the protein content before chemotherapy,the difference was statistically significant，1)P<0.05.

GroupsCD3+CD4+CD8+CD4+/CD8+CD16+/CD56+Pre-chemotherapy64.358±6.12528.976±3.12533.620±4.2161.078±0.02716.209±1.128Post-chemotherapy69.783±6.2311)34.536±3.2611)25.751±4.1131)1.525±0.0331)21.094±1.0351)

Note：Compared with the protein content before chemotherapy,the difference was statistically significant，1)P<0.05.

图2 乳腺癌组织中mRNA的表达Fig.2 mRNA expression in breast cancer tissuesNote: Compared with the mRNA level of breast cancer pre-chemotherapy,the difference was statistically significant，*.P<0.05.

图3 蛋白含量检测结果Fig.3 Protein content test resultsNote: Compared with the protein level of breast cancer pre-chemotherapy,the difference was statistically significant,*.P<0.05.

2.5mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg5 mRNA表达含量 与化疗前乳腺癌组织相比，卡培他滨联合奥沙利铂化疗后乳腺癌组织中mTOR和p62 mRNA表达含量显著降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg5 mRNA表达含量显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，图2。

2.6mTOR、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg5蛋白含量检测结果 图3，与化疗前乳腺癌组织相比，卡培他滨联合奥沙利铂化疗后乳腺癌组织中mTOR和p62 蛋白表达含量显著降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg5蛋白表达含量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

卡培他滨是新一代应用于抗肿瘤的氟尿嘧啶类化合物，口服经肠黏膜迅速吸收及活化，在肝脏被羧基酯酶转化为无活性的中间体5′-脱氧-5′氟胞苷，在胞苷脱氨酶的作用下于肝脏和肿瘤组织内转化为5′-脱氧-5′氟尿苷，最后经过胸腺嘧啶磷酸化酶催化在肿瘤细胞内转变为 5-Fu[8,9]。由于肿瘤组织中胸腺嘧啶磷酸化酶活性显著高于正常组织，因此卡培他滨在肿瘤部位具有更高的活性，对化疗不敏感的缺氧区域活性更高，毒副作用相对较小[10,11]。奥沙利铂属于第三代铂类抗癌药，是细胞周期非特异性药物，其抗癌谱和主要作用机制与其他铂类药作用机制类似，主要是以肿瘤细胞内DNA为靶作用部位，形成链间和链内交联阻断拮抗DNA合成，从而产生细胞毒和抗肿瘤活性[12,13]。研究表明，奥沙利铂对人多种肿瘤细胞均有抑制作用和抗瘤活性，与氟尿嘧啶(5-FU)联合应用具有协同作用，毒副反应较轻[14,15]。

机体的免疫及肿瘤免疫主要由 T 淋巴细胞介导，CD3+T淋巴细胞代表总T淋巴细胞。根据其表面标志和分化抗原的不同，可以将 T 细胞分为CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞，其中CD4+T细胞可以分泌大量细胞因子辅助CD8+T 细胞及 NK 细胞杀伤肿瘤，具有免疫记忆和直接杀伤肿瘤细胞的功能[16]。CD8+T抑制性 T 淋巴细胞，具有抑制体液和细胞免疫的功能。正常情况下，CD4+/CD8+细胞处于动态平衡状态，正常人比值基本恒定在1.5～2.5，乳腺癌恶性肿瘤患者因 T 淋巴细胞数量减少、功能不全、CD4+/CD8+比例失调，从而出现患者机体细胞免疫功能低下[17]。NK 细胞是机体天然免疫的主要承担者，具有细胞毒性效应，可以直接杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞及移植的组织细胞和进行免疫调节，是免疫应答中最早发挥作用的效应细胞及人体抗肿瘤和抗感染的第一道防线，人类 NK 细胞主要为 CD16和 CD56 阳性[18]。本研究表明，给予乳腺癌患者卡培他滨联合奥沙利铂化疗后，患者体内CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、CD16+/CD56+表达量显著升高，CD8+含量显著降低，说明卡培他滨联合奥沙利铂可有效调节肿瘤患者体内的免疫应答过程，有效发挥抗肿瘤作用。

细胞自噬可以通过与细胞生长、增殖、存活和死亡相关的多种信号传导途径诱导和加速肾小管上皮细胞的损伤和死亡[19,20]。LC3作为自噬激活的主要细胞学标志，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，主要由AMPK/mTOR 信号通路调控。Beclin1是一种抑癌基因，是酵母自噬基因Atg6/Vps30 的同源基因，依靠beclin1-PI3KC3复合体参与自噬体的形成，p62是SQSTMI编码的泛素结合蛋白，也是自噬的选择性底物之一，其参与泛素蛋白酶系统和自噬相关蛋白降解，也在介导细胞信号转导、蛋白更新和基因转录调控过程参与[5,6]。Atg5-Atg12-Atg16复合物也通过组分解离而促进吞噬细胞发育[21,22]。mTOR 激酶作为自噬的主要信号通路调节剂，在富含氨基酸和生长因子等营养充足的情况下，mTOR在细胞内被激活并阻断自噬通路；在细胞处于饥饿环境或营养缺乏的情况下，mTOR在细胞内活性被抑制，反向调节细胞自噬通路[23,24]。卡培他滨联合奥沙利铂激活自噬通路可能的机制有：①通过抑制AMPK/mTOR表达以激活自噬通路[25]；②通过下调p53/bnip3信号通路以激活自噬通路[26]；③诱导wnt/β-catenin信号通路，实现对自噬水平的负性调节[27]。

本研究结果表明，乳腺癌患者应用卡培他滨联合奥沙利铂化疗后，总有效率为56.67%，疗效显著。免疫组化、Western blot和Real-Time PCR结果表明，给予乳腺癌患者应用卡培他滨联合奥沙利铂治疗后，乳腺癌患者体内mTOR和p62 mRNA表达和蛋白含量显著降低，LC3-Ⅱ、Beclin-1和Atg5 mRNA表达和蛋白含量显著上升，说明应用联合药物化疗后，患者体内由mTOR和LC-3Ⅱ介导的自噬通路被激活，在乳腺癌细胞的增殖和凋亡过程中起到重要作用，参与调节肿瘤的发生、发展、治疗和转归。

综上所述，卡培他滨联合奥沙利铂可有效控制乳腺癌的疾病发生，产生一定的临床治疗作用。自噬相关蛋白及mTOR信号通路与乳腺癌的发生、发展和治疗效果密切相关，可以有效作为乳腺癌的治疗新靶点。