不同仔猪血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞体外培养的影响

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(1.金华职业技术学院，浙江 金华 321000；2.金华市农业科学研究院，浙江 金华 321000)

0 引言

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术，成纤维细胞具有易于培养，增殖快，形态和遗传性能稳定，可长期、完整、大量地保存生物体遗传信息的特点[1]。目前，成纤维细胞被广泛用于生产体细胞克隆猪、转基因猪以及制作猪诱导多功能性干细胞。成纤维细胞的体外培养多应用异体血清，除了非同源外，在异体血清应用的同时,也造成了自体血清的浪费。试验以金华猪耳缘组织成纤维细胞为研究对象，探讨用不同浓度仔猪血清培养成纤维细胞，观察金华猪耳缘组织成纤维细胞在3种不同仔猪血清浓度培养基中的生长情况，为仔猪血清在细胞培养中的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1～3月龄金华猪仔猪耳缘组织

1.2 主要试剂和仪器

DMEM(Hyclone)，25 mL细胞培养瓶(Fisher)，血球细胞计数器(上海申工)，仔猪血清(自备)，青霉素、链霉素混合液(Hyclone)，0.25%胰蛋白酶溶液(Hyclone)， PBS液(Hyclone),CKX41倒置显微镜(OLYMPAS)，311型二氧化碳培箱(Thermo)，酶标仪(伯乐)。

1.3 实验方法

1.3.1 材料

选1～3月龄的金华猪仔猪，在猪耳缘处选择血管较少部位刮毛，无菌剪取一小部分组织，将组织块放入含250IU/mL双抗的PBS中，带回实验室。

1.3.2 处理

在超净台中将猪耳组织块用75%酒精浸泡30～60 s，切取耳缘组织块约0.5 cm×0.5 cm大小，把皮肤上的毛再次刮干净放入无菌培养皿，再用双抗PBS溶液洗涤3～5次。用眼科剪刀反复剪切，剪成1 mm3大小的小块，用双抗PBS洗涤3次，最后1次弃去上清液，沉淀的组织备用。

1.3.3 原代培养

采用组织块贴壁培养法，将组织块贴于25 mL细胞培养瓶中，每小块间距约 0.3 cm，每瓶接种25～30块。翻转培养瓶，使有组织块的一面向上,然后在细胞培养瓶内分别加含5%、10%、15%仔猪血清的细胞培养液。将有组织块的一面向上放入培养箱，静置4 h后，轻轻将培养瓶翻转过来，使培养液浸没组织块，然后放入CO2培养箱，5% CO2、37℃、饱和湿度下静置培养2 d后置于倒置显微镜下观察组织块迁移率同时更换培养液[2]。

1.3.4 传代培养

当培养细胞汇合达80%～90%时，进行细胞传代。吸除培养瓶中的培养液，用PBS清洗2次后，再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hanks液，37℃温度下消化培养瓶中的细胞，在显微镜下看到大部分成纤维细胞脱壁，立即加入完全培养液终止消化，吹打细胞，使之分散。以1 000 r/min，离心5 min，弃上清， 再加入5 mL培养液吹打重悬细胞，再次以1 000 r/min ，离心5 min，弃上清液，以 2 mL培养液吹打重悬浮细胞，使用血球计数板用0.4%台盼蓝染液进行活细胞计数，使细胞密度为 2×105个/mL，随后，接入新的培养瓶中，置于CO2培养箱中继续培养。

1.4 MTT法检测

用含不同浓度仔猪血清培养基配成单细胞悬液，在96孔板上每孔加入100 μL，细胞浓度为1×104/mL，每组7孔，培养2 d后，每孔加入MTT溶液(5g/L)20 μL，继续培养4 h，轻轻吸弃上清液。每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择波长490nm，用酶标仪测定各孔光吸收值(A值)[3]。

1.5 统计学处理

实验数据以均值±标准误表示，用Graphpad prism5 统计软件进行单因素方差分析，不同组别数据间比较采用t检验。

2 结果

2.1 不同仔猪血清浓度培养情况观察

金华猪耳缘组织块培养用仔猪血清浓度为10%与15%时，培养3～4 d倒置显微镜下可见单个细胞沿组织块周围游离出来(图1)，生长状态好，培养8 d大量细胞从组织块迁移出来(图2)，培养12 d可以长满培养瓶底(图3)。仔猪血清浓度为5%时，培养到10 d后才见少量细胞沿组织块周围爬出，细胞生长缓慢，21 d左右才铺满培养瓶底。细胞传代2～3次后，即可得到纯化的成纤维细胞(图4)，细胞呈梭形、三角形等，为典型的成纤维形态，胞质近中央处有椭圆形胞核，成群细胞呈现束状、漩涡状等走势。

图1 仔猪血清浓度为10%培养3 d组织块有少量细胞游离出来(100×)

图2 仔猪血清浓度为10%培养8 d组织块有大量细胞迁移出来(100×)

图3 仔猪血清浓度为10%培养12 d组织块细胞长满培养瓶底(200×)

图4 仔猪血清浓度为10%传代培养的第3代成纤维细胞(200×)

2.2 MTT检测结果

金华猪耳缘组织成纤维细胞在含10%、15%仔猪血清的培养基中，细胞生长均旺盛，活力较强，差异无统计学意义(P>0.05)；在含5%仔猪血清的培养基中，细胞生长缓慢，细胞活力明显低于10%与15%仔猪血清培养基中的细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。(如图5所示)

图5 不同仔猪血清浓度对成纤维细胞活性增殖影响

3 讨论

动物原代细胞培养主要分为2种方法，组织块块贴壁培养法和酶消化法[4]。本试验采用组织块贴壁方法培养猪耳缘组织成纤维细胞。该方法简单，容易获得成纤维细胞，但是纯度不高，有上皮细胞的存在，根据不同类型细胞对胰酶的敏感度不同进行纯化，培养2～3代后方可获得较纯的成纤维细胞。

培养基是体外细胞培养赖以生存和增殖的基础,由于血清中含有多种人工合成营养液中所缺少的物质，如生长激素和生长调节因子等，生长激素能调节细胞的多种生命活动，生长因子能刺激细胞生长、增殖分化[5]。细胞培养常用的是胎牛血清，为避免异源血清带来的危险损害和血源性传播性疾病，故将仔猪血清应用于猪耳缘组织成纤维细胞的培养。本试验采用Hyclone公司生产的DMEM培养液，分别加入含仔猪血清量为5%、10%、15%的培养基进行原代培养，探讨不同浓度的仔猪血清对金华猪耳组织成纤维细胞体外培养的影响。结果表明，仔猪血清浓度在10%、15%时即可满足成纤维细胞生长的营养需要，10%、15% 的仔猪血清浓度对细胞影响的差异并不显著，所以采用含10%的仔猪血清浓度培养基培养金华猪耳缘组织成纤维细胞，即可满足细胞生长的需要，又可节省血清用量。仔猪血清浓度为5%时，血清不能满足细胞生长需要，细胞生长速度较慢，细胞活力明显低于10%与15%仔猪血清培养基中的细胞。综上所述，仔猪血清浓度对金华猪耳缘组织成纤维细胞培养影响比较明显，仔猪血清浓度为10%、15%时，二者对细胞培养状况的影响差异不显著(P>0.05)，二者与仔猪血清浓度为5%比较时差异显著(P<0.05)，提示不同仔猪血清浓度的培养体系在对体外培养金华猪耳缘组织成纤维细胞有着特殊的影响。这与课题组早期实验采用不同胎牛血清浓度对金华猪耳组织成纤维细胞体外生长的影响，屠平光等[6]结论一致，说明金华猪耳组织成纤维细胞培养不管用异体血清还是自体血清，最适培养血清浓度均为10%。

本试验研究表明，用含10%浓度仔猪血清的DMEM培养基，培养金华猪耳组织成纤维细胞，可以满足细胞生长活性和增殖能力的要求，为仔猪血清在成纤维细胞培养中的应用提供一定的实验依据。