兔眼前部缺血性视神经病变动物模型的制备

2018-10-25郭辉田紫煜王影刘绍燕李淑敏安荣荣苑文佳孟言白鹏

中国中医眼科杂志 2018年4期

郭辉，田紫煜，王影，刘绍燕，李淑敏，安荣荣，苑文佳，孟言，白鹏

为研究前部缺血性视神经病变（anterior ischemic optic neuropathy，AION）的发病机制，曾建立了许多该疾病的动物模型，其中光动力法制备的大鼠AION模型在国内应用最普遍[1]。兔形目动物由于体型较大，性情温顺，更适用于清醒状态下的针刺实验研究，故最常被针刺研究所采用。但文献未见以兔眼制作该模型的报道，而兔的解剖结构及其对光敏剂的代谢均与大鼠有一定差异，可能产生不同强度的光动力效应。为此，本研究通过光动力法，对兔眼制作AION模型进行了小规模的探索，亦获得了相对适用于兔眼的具体激光参数，期望能成功制备出兔眼AION动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰大耳白兔12只，普通级，体重1.8～2.5kg，雌性。由北京海淀区兴隆实验动物养殖场提供，许可证号：SCXK（京）2011-0006。所有兔散瞳后经裂隙灯及直接眼底镜检查无眼部疾病。

1.2 试剂及仪器

复方托吡卡胺滴眼液（参天制药（中国）有限公司）、孟加拉玫瑰红（90%纯度）（美国Sigma公司）、20%荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司）、4%多聚甲醛（北京优尼康生物科技有限公司）、苏木素染液（北京中杉金桥生物技术有限公司）、伊红染液（北京中杉金桥生物技术有限公司）、裂隙灯（美国Lumenis公司）、Novus Varia固体多波长眼底激光系统（美国Lumenis公司）、眼底荧光血管造影机（德国heidelberg公司）、90 D前置镜（美国Ocular公司）。

1.3 模型制备

所有兔子均在 12 h明（06:00-18:00）/12 h暗（19:00-5:00），温度在 20～25℃，湿度在 40～70%，背景噪音＜60 dB的环境中喂养。兔子在动物房适应性饲养3 d后，将兔子称重、编号，在兔子右后肢肌肉注射盐酸氯胺酮注射液（40 mg/kg）及盐酸塞拉嗪注射液（5 mg/kg）配制成的水溶液麻醉后，以右眼为实验眼，复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，经耳缘静脉注入孟加拉玫瑰红（Rose Bengal，RB）2.5 mmol/(mL·kg)，立即固定于裂隙灯前，右眼加置90 D前置镜，左眼用黑色不透光眼罩遮盖。确定视盘位置后，用532 nm绿光、功率75 mW、直径1000 μm光斑照射实验眼视盘中上2/3区域60 s，模型制备完毕[2]。

1.4 眼底镜及FFA检查

造模结束1 d后，在兔子腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）进行麻醉，右眼滴入复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，立即将兔子固定于裂隙灯前，对侧眼用黑色不透光眼罩遮盖，兔子实验眼加置90 D前置镜，观察其眼底视盘。观察完毕后经耳缘静脉注射20%荧光素钠注射液1 ml/kg，立即行FFA检查。摄取视野为30度，获取视盘及其周围区域图像，观察视盘及视网膜血管充盈过程的动态变化。

1.5 HE染色

造模后第2 d，10%水合氯醛，7.5 ml/kg，腹腔麻醉新西兰大耳兔。以呼吸均匀、用力钳夹兔腿无肌肉收缩为度。用直齿镊夹起穹窿结膜，再用小号弯剪剪开结膜并探入，将弯剪背弓面朝向眼球，沿同一方向360°剪开球结膜、球筋膜，遇眼外肌时直接剪断，避开大血管，依次剪断下、内、上、外四条眼外肌，向下深探，剪断视神经，取出眼球。耳缘静脉推注空气约30 ml，处死动物。对眼球及视神经组织进行4%多聚甲醛包埋固定；室温下，50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇依次各浸泡1 h。组织梯度脱水，石蜡包埋。包埋时视神经长轴的方向与包埋盒长轴的方向一致，用石蜡切片机沿视神经的长轴进行连续切片，厚度为4 μm。HE染色，用光学显微镜观察形态学变化，并以400×倍率摄取距视盘边缘2个视野窗（约2×265 μm=530 μm）处图像。

2 实验结果

2.1 眼底镜检查

造模后1 d，新西兰大耳兔眼底镜观察可见实验眼（右眼）视盘上半水肿，边界不清。空白对照眼（左眼）视盘边界清晰，无异常变化。

2.2 FFA检查

由图1可以看出造模后1 d，造影早期可见兔子视盘上方低荧光，中、晚期高荧光，这与AION患者临床表现相似，说明造模成功[2]（图1）。

2.3 视网膜组织形态结构病理观察

正常组视网膜各层结构完整，视神经组织内细胞形态正常，排列整齐，神经节细胞无脱落，排列紧密，染色均匀（图2A）。模型组神经节细胞层出现增生现象，且排列十分紊乱，内核层明显变薄，细胞数目明显减少（图2B）。

3 讨论

目前对AION动物模型诱导的方法的研究还处于早期阶段，尚未建立标准化的造模技术。1996年，申维勇等试用手术方法制成脉络膜缺血及AION模型[3]。虽脉络膜缺血与前部视神经缺血时常并见，但对科研来说未免欠缺严谨性，故该方法未能推广。20世纪80年代，国外学者应用光动力法成功建立动物中枢神经系统的缺血模型、视网膜缺血模型，2003年，Bernstein等[4]报道应用此方法成功制备AION大鼠模型，取得了较为理想的效果。Wang等[5-8]在国内首先利用光动力方法成功诱导出AION的大鼠眼模型。他们在SD大鼠尾静脉注入血卟啉衍生物(hematoporphyrinderivative，HPD)10 mg，避光 2 h 后在Volk 78 D前置镜下照射视盘中上2/3面积，采用波长为645 nm、能量为80 mW的氪红激光持续照射120 s，此类模型的眼底、FFA、电生理以及病理学表现均与AION的临床过程相似，因此认为是较为理想的造模方法。

从光敏剂的选择上来说，目前应用光动力学方法制备AION动物模型时采用的光敏剂主要是孟加拉玫瑰红 (Rose Bengal，RB)[9]。国内也有学者应用HPD或维替泊芬[5-8]。RB是一种碘化荧光素衍生物，其诱导单线态氧的的作用十分强大，目前已经明确其能导致血栓形成。RB在体内的代谢过程符合一级代谢动力学特征，即在静脉注射后血液浓度会迅速下降，因此激光照射诱导模型过程需要在RB注射开始后1 min内完成[9]。本次实验在兔子耳缘静脉注入RB后1 min内完成激光发射，并将照射时间确定在60 s，以确保达到最佳的光化学反应效果。RB的最大激发光波长为540 nm，因此实验过程中选择了与该波长十分接近的532 nm绿光进行激发，光斑的大小取决于家兔视盘的直径，故选择光斑直径大小为 1000 μm。

激光照射的位置选择在兔子视盘上2/3区域进行照射，更接近于本病临床上视野的象限性缺损。本课题组从前人的研究中汲取经验，并根据所具备的实验条件及实验者操作能力，通过孟加拉玫瑰红光动力法，成功制备出AION兔眼模型。造模后，通过眼底镜及FFA检查观察视盘情况、HE染色观察兔眼组织病理变化证实了模型的可靠性。我们深知，对于一个新的理想的动物模型，还有大量的工作需要完善，比如视觉诱发电位（VEP）等功能学指标的检测与评估、造模后视盘及视神经血管的动态变化过程等等，这将是我们下一步工作。

综上所述，选择合适光敏剂的类型、剂量及与之相符合的激光类型、激光参数、激光照射时间等是成功制备AION动物模型的基础条件。孟加拉玫瑰红诱导下激光照射法可以作为兔眼AION模型制备方法。但是由于实验条件的限制，未能进一步对激光参数、激光照射时间等变量进行研究。