双丹明目胶囊对糖尿病大鼠模型视网膜组织结构改变的影响

彭俊，潘坤，刘峥嵘，秦裕辉，彭清华

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）中最常见和严重的微血管并发症，是导致DM患者视力下降的主要原因，若不及时治疗，可造成不可逆的视功能的损害。秦裕辉教授认为，糖尿病视网膜病变的主要病机为肝肾亏虚、脉络瘀阻，在长期临床实践的基础上，创制了用于治疗DR的双丹明目胶囊。前期研究表明，双丹明目胶囊能有效降低DR大鼠血糖和糖化血红蛋白含量，降低血小板黏附率，改善血液流变性，促进血液循环[1-3]。本实验观察了双丹明目胶囊对糖尿病大鼠视网膜组织结构改变的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物取健康，无眼部疾患，1个月龄SD大鼠 40 只，体质量 200～250 g，SPF 级，远交系，由北京维通利华实验动物有限公司提供。实验前检查双眼眼部情况无异常，排除全身病变。动物置于18～20℃，相对湿度60%～70%，通风干燥的SPF动物实验室，予以经严格消毒的实验鼠生长颗粒料及Ⅲ级清洁饮用水饲养，每隔2 d清洗消毒笼具、饮水器具。

实验药品双丹明目胶囊（女贞子、旱莲草、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮、丹参、三七、菝葜、牛膝等），由湖南省中医药研究院中药研究所提供，批号：国药准字Z20080062。羟苯磺酸钙胶囊（多贝斯），宁夏康亚药业有限公司，250mg/粒，批号：国药准字H20030809。重组人血管内皮抑制素注射液（恩度），烟台麦得津生物工程股份有限公司，15 mg/3 ml，批号：国药准字S20050088。

实验试剂血管内皮生长因子-a（vascular endothelial growth factor，VEGF-a）、VEGF-b、VEGF-c、胎肝激酶-1（fetal liver kinase-1，Flk-1），武汉博士德生物技术有限公司；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），Sigma公司；戊巴比妥钠，上海化学试剂分装厂；苏木精-伊红，北京鼎国生物公司；4%多聚甲醛、1%饿酸、丙酮、Epon812环氧树脂、醋酸铀、柠檬酸铅、醋酸异戊脂，湖南福滋堂生物公司；4%多聚甲醛，湖南中医药大学病理实验室提供；Harris苏木素、伊红、3%过氧乙酸，北京中杉金桥生物技术公司提供。

实验器材JY3002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HHS-2电子恒温不锈钢水浴锅：上海南阳仪器有限公司；LEICA DM LB2型显微照相系统，德国LEICA公司；Shandon325型石蜡切片机，英国Shandon公司；DNP-9162型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Motic B5显微摄像系统，麦克奥迪实业集团公司；LEICA显微镜，德国LEICA公司；JSM-1200透射电镜，日本JEOL公司；双目显微镜，德国Motic公司；双目显微照相机，德国Motic公司；RM2235轮转石蜡切片机，德国徕卡公司；Motic 6.0数码医学图像分析系统，深圳市深沅恒科技有限公司。

1.2 实验方法

分组动物购回常规饲养1周后，采用随机数字法将40只大鼠分为4组，每组10只大鼠20只眼。A组：空白组（正常组）；B组：模型对照组；C组：双丹明目组；D组：阳性对照组。

造模除A组外的30只大鼠进行造模，造模前大鼠禁食10 h，自由饮水。STZ 50mg/kg的剂量一次性大鼠尾静脉注射。A组鼠尾静脉注射等量生理盐水。72 h后取尾静脉血，强生血糖测试仪测血糖；尿糖试纸定性测尿糖。空腹血糖浓度＞16.7 mmol/L、尿糖在+++以上者，即为糖尿病大鼠。造模后观察1周，稳定者为造模成功，然后开始计算病程。造模后无大鼠死亡，2只大鼠血糖值偏低，进行第2次尾静脉注射后达标。

给药方法各组动物自造模后1周开始连续灌胃，用药4周后，处死一半动物（各5只大鼠），其余动物继续灌胃用药4周，共8周，再处死。各组大鼠均不限饮食，每日更换垫料1次，按时通风，保持环境安静。（1）空白组、模型组：以生理盐水10 ml/kg灌胃。（2）双丹明目胶囊组：使用双丹明目胶囊溶液灌胃，剂量12.5 ml/kg。（3）阳性对照组：用羟苯磺酸钙溶液灌胃+重组人血管内皮抑制素玻璃体内注射[2]，羟苯磺酸钙灌胃1次/d，重组人血管内皮抑制素5g/L，造模后第10天开始玻璃体注射，1次/10 d。

取材2%戊巴比妥钠过量麻醉后断头法处死动物，即刻摘除眼球以10%的福尔马林固定24 h，去除眼前节，分离出视网膜组织，流水冲洗8 h，经梯度酒精脱水后，行浸蜡、包埋、切片（厚度 4 μm）。

视网膜组织形态的光镜观察HE染色后，在光学显微镜下观察HE染色标本视网膜各层结构的形态学变化。

视网膜组织形态的电镜观察部分标本 （材料小于1 mm3）经2.5%戊二醛前固定，清洗，1%饿酸4℃下固定3 h，梯级乙醇脱水，Epon812环氧树脂与丙酮溶液浸透30 min，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片光镜观察定位后做超薄切片，经柠檬酸铅和醋酸铀双重染色后采用JSM-1200透射电镜观察。

2 结果

2.1 光镜下观察各组大鼠视网膜结构

成模后用药第4周：空白组，视网膜结构层次清晰，视锥视杆细胞排列整齐，无细胞水肿、无坏死、无血管增生（图1A）。模型组，视网膜组织水肿明显，毛细血管壁增厚，内皮细胞增生，纤维组织增生明显（图1B）。双丹明目组，视网膜组织轻度水肿，结构层次清晰，部分毛细血管内皮细胞轻度增生（图1C）。阳性对照组，视网膜组织轻度水肿，结构层次清晰，毛细血管内皮细胞增生明显（图1D）。

成模后用药第8周：空白组，视网膜结构层次清晰，视细胞各层结构排列有序，形态规则，无细胞水肿、无坏死、无血管增生等（图2A）。模型组，视网膜组织水肿明显，排列疏松，形态欠规则，毛细血管壁增厚，内皮细胞增生，纤维组织增生明显（图2B）。双丹明目组，视网膜结构层次基本清晰，组织稍有水肿，排列较疏松，形态较规则（图2C）。阳性对照组，视网膜结构层次较清晰，组织水肿比模型组水肿明显减轻，排列较疏松，形态尚规则（图2D）。

图1 造模成功后用药第4周各组大鼠视网膜组织HE染色像（×400）。1A.空白组，视网膜结构层次清晰，视锥视杆细胞排列整齐，无细胞水肿、无坏死、无血管增生；1B.模型组，视网膜组织水肿明显，毛细血管壁增厚，内皮细胞增生，纤维组织增生明显；1C.双丹明目组，视网膜组织轻度水肿，结构层次清晰，部分毛细血管内皮细胞轻度增生；1D.阳性对照组，视网膜组织轻度水肿，结构层次清晰，毛细血管内皮细胞增生明显

图2 造模成功后用药第8周各组大鼠视网膜组织HE染色像（×400）。2A.空白组，视网膜结构层次清晰，视细胞各层结构排列有序，形态规则，无细胞水肿、无坏死、无血管增生等；2B.模型组，视网膜组织水肿明显，排列疏松，形态欠规则，毛细血管壁增厚，内皮细胞增生，纤维组织增生明显；2C.双丹明目组，视网膜结构层次基本清晰，组织稍有水肿，排列较疏松，形态较规则；2D.阳性对照组，视网膜结构层次较清晰，组织水肿比模型组水肿明显减轻，排列较疏松，形态尚规则

2.2 电镜观察各组大鼠视网膜超微结构

成模后用药第8周透射电镜下观察视网膜超微组织结构：空白组，视网膜内皮细胞形态正常，呈梭形，细胞间有较好的连接装置，视网膜毛细血管腔壁完整，基底膜连续、未见增厚（图3A）。模型组，视网膜毛细血管内皮细胞明显肿胀，胞体变圆，突向管腔，线粒体肿胀，空泡化，基底膜增厚，部分增厚较明显（图3B）。双丹明目组，视网膜组织结构较完整，视网膜毛细血管基底膜稍增厚，可见周细胞轻度水肿，线粒体肿胀，少数出现嵴消失及结构紊乱，血管内皮细胞未见明显改变（图3C）。阳性对照组，组织结构较完整，视网膜毛细血管病变较轻，毛细血管腔壁较光整，基底膜未见明显增厚，部分内皮细胞轻度增生，少数周细胞出现水肿，线粒体轻度肿胀，结构稍欠清（图 3D）。

图3 造模成功后用药第8周各组大鼠视网膜组织透射电镜像。3A.空白组，视网膜内皮细胞形态正常，呈梭形，细胞间有较好的链接装置，视网膜毛细血管腔壁完整，基底膜连续、未见增厚；3B.模型组，视网膜毛细血管内皮细胞明显肿胀，胞体变圆，突向管腔，线粒体肿胀，空泡化，基底膜增厚，部分增厚较明显；3C.双丹明目组，视网膜组织结构较完整，视网膜毛细血管基底膜稍增厚，可见周细胞轻度水肿，线粒体肿胀，少数出现嵴消失及结构紊乱，血管内皮细胞未见明显改变；3D.阳性对照组，组织结构较完整，视网膜毛细血管病变较轻，毛细血管腔壁较光整，基底膜未见明显增厚，部分内皮细胞轻度增生，少数周细胞出现水肿，线粒体轻度肿胀，结构稍欠清

3 讨论

3.1 中医对糖尿病视网膜病变的认识

中医称糖尿病视网膜病变为“消渴内障”[4]，根据患眼视觉变化及视力下降情况，将其纳入不同的病症中，如“视瞻昏渺”“云雾移睛”“血灌瞳神”“暴盲”等。对于本病的认识，金代医家张子和在《儒门事亲》中指出：“消渴者，耗乱精神，过为其度，而燥热郁盛所成也……可变为雀目或内障”，认为燥热伤阴为其主要病机；明代赵献可认为“治消之法无分上中下，先治肾为急，惟六味八味及加减八味丸随证而服，降其心火滋其肾水则渴自止也”。明代王肯堂所著《证治准绳》亦云：“三消之久，精气亏虚，则目无所见”，认为本病为精血亏虚、目失所养而成。其后历代医家多在此基础上加以研讨发挥，多数认为消渴病日久，精亏液少，不能上承目络，目睛失养；或肝肾阴虚日甚，阴虚阳亢，虚火上炎，灼伤目络，而致视物模糊，甚至失明，概言之：阴精亏虚为其主要病机。现代医家借助眼底检查、眼底血管造影等手段，并从血流变、微循环、血生化等方面对本病作了科学的研究，发现“血瘀”在其发病机理中具有重要作用，因此，导师秦裕辉教授认为本病病因病机为：肾虚是根、阴虚为本、血瘀为标，概言之“肾虚血瘀”为其主要病机。“虚”为气血阴阳的虚损；“瘀”为瘀血，它贯穿病机演变过程的始终。因虚致瘀，虚瘀夹杂，以虚为本，以瘀为标，血瘀又是诱发和加快本病发展的病理基础。故治疗DR应该以“滋肾活血”为基本法则。

基于这一法则，秦裕辉教授创制了双丹明目胶囊（国药准字Z20080062），开发出国内第一个专治糖尿病视网膜病变的中药新药，填补了国内空白。该药由女贞子、旱莲草、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、牡丹皮、丹参、三七、菝葜、牛膝等药物组成。方中女贞子、旱莲草滋补肝肾为君药；山茱萸、山药补肾养肝、健脾固精，丹参、三七养血活血、化瘀通络共为臣药；牡丹皮、泽泻、茯苓、菝葜清肝泻火、除湿利水为佐药；牛膝味苦酸、性平，归肝、肾经，功能活血逐瘀、强筋壮骨且性善下行，可防血气上逆，为使药。诸药合用共奏益肾养肝、活血明目之功，主治肝肾阴虚、瘀血阻络所致的糖尿病视网膜病变。多中心临床试验取得较好的疗效[5-7]，证实该药能改善患者眼底病变，促进视力恢复，起到治疗糖尿病视网膜病变的作用。在2009年，由广州中医药大学第二附属医院、北京中医药大学东直门医院、南京中医药大学附属医院、湖南中医药大学第一附属医院联合临床应用中，用双丹明目胶囊与羟苯磺酸钙（导升明）作对照，发现治疗后患者眼科检查中的视力明显提高。在治疗8周、16周后的眼科检查总分及微血管瘤计分，双丹明目胶囊疗效优于导升明组，治疗16周后视力检查计分优于导升明组，疾病显效率、总有效率高于导升明组；而不良反应率低于导升明组[7]。我们的前期药理研究[1--3]也发现，双丹明目胶囊（原名降糖明目胶囊）联合降糖药物能大幅度地促进其降糖效果，单用也能降低血小板黏附率，改善血液流变性，有促进血液循环作用。

3.2 双丹明目胶囊对糖尿病大鼠模型视网膜组织结构的影响

本研究通过建立糖尿病大鼠模型，观察双丹明目胶囊对糖尿病大鼠模型视网膜病变的干预作用，光镜下对其视网膜病理组织学观察发现：双丹明目组的大鼠视网膜组织形态和超微组织结构改变较模型组明显好转，其结构层次清晰，仅组织轻度水肿，部分毛细血管内皮细胞轻度增生；而模型组大鼠视网膜组织水肿明显，毛细血管壁增厚，内皮细胞增生，纤维组织增生明显。电镜下观察视网膜的超微结构发现：模型组大鼠视网膜毛细血管病变明显，其基底膜增厚，部分增厚较明显，内皮细胞增生，有微绒毛样突起，并向管腔突出，管腔狭窄，周细胞水肿、退变甚至消失，部分线粒体可见空泡化；神经细胞病变更明显，线粒体肿胀显著，部分空泡化，染色质溶解，嵴间隙扩张甚至消失，视细胞外节膜盘甚至有断裂、溶解。双丹明目胶囊治疗8周后，大鼠视网膜毛细血管病变轻微，视网膜毛细血管腔壁较光整，基底膜未见增厚，仅少数毛细血管周细胞水肿，线粒体轻度肿胀，结构稍欠清，部分内皮细胞轻度增生。说明双丹明目胶囊能明显改善糖尿病大鼠模型视网膜组织形态和超微组织结构，能改善DR大鼠视网膜血管微结构，抑制新生血管的增生。